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倒置相差显微镜是相差显微镜和的结合即既具有的倒置观察方式同时成像原理则与相差显微镜成像原理相一致倒置相差显微镜其照明系统位于镜体上方而物镜和目镜则位于下部这样在集光器和载物台之间有较大的工作距离可以放置培养皿细胞培养瓶等容器辅助以相差的光学系统可以很方便地对培养中的细胞进行观察且相差系统的观察效果远好于一般光学观察系统如果安装了显微操作系统则可以利用机械臂对细胞甚至染色体进行精细地操作如核移植基因导入染色体显微切割等当同一种光通过细胞时由于细胞不同部分对光的折射率不同因此通过细胞的光线和未通过细胞的光线便可以产生相位差再通过特定的相差板使之发生干涉如果衍射光线和0-级光线相位相反则合光的振幅减小物体图像变暗如果相位相同则合光的振幅增大图像变亮则可以产生明暗不同的图像因此无色透明的样品在显微镜下表现出明暗的对比从而可以被识别
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光学显微镜Optical Microscope简写OM是利用光学原理把人眼所不能分辨的微小物体放大成像以供人们提取微细结构信息的光学仪器
早在公元前一世纪人们就已发现通过球形物体去观察微小物体时可以使其成像后来逐渐对球形表面能使物体放大的有了认识1590年和意大利的制造者已经造出类似的放大1610年前后的和的在研究的同时改变和之间的得出合理的显微镜结构当时的光学工匠纷纷从事显微镜的制造推广和改进
17世纪中叶的和荷兰的都对显微镜的发展作出了卓越的贡献1665年前后胡克在显微镜中加入粗动和微动机构系统和承载片的工作台这些部件经过不断改进成为现代显微镜的基本组成部分
光学显微镜年期间列文·虎克制成单组元式的高倍显微镜其中九台保存至今胡克和列文·虎克利用自制的显微镜在动植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就19世纪高质量消色差浸液物镜的出现使显微镜观察微细结构的能力大为提高1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜19世纪70年代德国人奠定了显微镜成像的古典理论基础这些都促进了显微镜制造和显微观察的迅速发展并为19世纪后半叶包括科赫巴斯德等在内的家和家发现和提供了有力的工具
在显微镜本身结构发展的同时显微观察技术也在不断创新1850年出现了偏光显微术1893年出现了显微术1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术他为此在1953年获得了
古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合它以人眼作为接收器来观察放大的像后来在显微镜中加入了装置以感光胶片作为可以记录和存储的接收器现代又普遍采用光电摄象管和耦合器等作为显微镜的接收器配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统
为的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸近代的光学显微镜通常采用两级放大光学显微镜分别由物镜和目镜完成被观察物体位于物镜的前方被物镜作第一级放大后成一倒立的然后此实像再被目镜作第二级放大成一人眼看到的就是虚像而显微镜的总放大就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积放大倍率是指直线尺寸的放大比而不是面积比光学显微镜一般由聚光照明系统物镜目镜和调焦机构组成载物台用于承放被观察的物体利用调焦旋钮可以驱动调焦机构使载物台作粗调和微调的升降运动使被观察物体调焦清晰成象它的上层可以在水平面内沿作精密移动和转动一般都把被观察的部位调放到视场中光学显微镜结构心
聚光照明系统由灯源和聚光镜构成聚光镜的功能是使更多的光能集中到被观察的部位照明灯的特性必须与显微镜的接收器的工作波段相适应
物镜位于被观察物体附近是实现第一级放大的镜头在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜转动就可让不同倍率的物镜进入工作光路物镜的放大倍率通常为5～100倍
物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件一般变倍比为6.31变倍范围0.8X-5X常用的有能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜质量更高的还有能对三种色光校正色差的复消色差物镜能保证物镜的整个像面为平面以提高视场边缘成像质量的平像场物镜高倍物镜中多采用浸液物镜即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充为1.5左右的液体它能显著的提高显微观察的
目镜是位于人眼附近实现第二级放大的镜头镜放大倍率通常为5～20倍按照所能看到的视场大小目镜可分为视场较小的普通目镜和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类
载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦获得清晰的图像用高倍物镜工作时容许的调焦范围往往小于所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构
显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念光学显微镜当选用的物镜不够大即分辨率不够高时显微镜不能分清物体的微细结构此时即使过度地增大放大倍率得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像称为无效放大倍率反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足则显微镜虽已具备分辨的能力但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见所以为了充分发挥显微镜的分辨能力应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配
聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响但又是易于被使用者忽视的环节它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明聚光镜发来的光束应能保证充满物镜否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率为此目的在聚光镜中设有类似照相物镜中的可以调节开孔大小的可变孔径用来调节照明光束孔径以与物镜孔径角匹配
改变照明方式可以获得亮背景上的暗物点(称亮视场照明)或暗背景上的亮物点(称暗视场照明)等不同的观察方式以便在不同情况下更好地发现和观察微细结构光学显微镜有多种分类方法智泰按使用目镜的数目可分为三目双目和单目显微镜按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜按观察对像可分为生物和等按光学原理可分为偏光相衬和微分对比显微镜等按光源类型可分为普通光荧光红外光和激光显微镜等按接收器类型可分为目视摄影和电视显微镜等常用的显微镜有双目金相显微镜紫外等
双目体视显微镜是利用双通道光路为左右两眼提供一个具有立体感的图像它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的以此形成的视觉图像双目体视显微镜在生物医学领域广泛用于操作和显微外科手术在工业中用于微小和集成电路的观测装配检查等工作
金相显微镜是专门用于观察和等不透明物体金相的显微镜这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光而后者以透射光照明在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面被物面反射后再返回物镜成像这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作光学显微镜紫外荧光显微镜是用紫外光激发荧光来进行观察的显微镜某些标本在可见光中觉察不到结构细节但经过处理以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光形成可见的图像这类显微镜常用于生物学和医学中
电视显微镜和电荷耦合器显微镜是以电视摄像靶或电荷耦合器作为接收元件的显微镜在显微镜的实像面处装入电视摄像靶或电荷耦合器取代人眼作为接收器通过这些光电器件把光学图像转换成电信号的图像然后对之进行尺寸检测颗粒计数等工作这类显微镜的可以与计算机联用这便于实现检测和信息处理的自动化多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合
扫描显微镜是成像光束能相对于物面作扫描运动的显微镜 在扫描显微镜中依靠缩小视场来保证物镜达到最高的分辨率同时用光学或机械扫描的方法使成像光束相对于物面在较大视场范围内进行扫描并用信息处理技术来获得合成的大面积图像信息这类显微镜适用于需要高分辨率的大视场图像的观测粗准焦螺旋大范围上下调动镜筒
细准焦螺旋小范围上下调动镜筒显微镜是一种精密的光学仪器已有300多年的发展史自从有了显微镜人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元不仅有能放大千余倍的光学显微镜光学显微镜而且有放大几十万倍的使我们对生物体的生命活动规律有了更进一步的认识在普通中学生物教学大纲中规定的实验中大部分要通过显微镜来完成因此显微镜性能的好坏是做好观察实验的关键显微镜的光学系统主要包括物镜目镜反光镜和四个部件广义的说也包括照明光源滤光器和等
物镜是决定显微镜性能的最重要部件安装在物镜转换器上接近被观察的物体故叫做物镜或接物镜
1物镜的分类
物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜和浸液物镜其中浸液物镜又可分为水浸物镜和油浸物镜常用放大倍数为90100倍
根据放大倍数的不同可分为 低倍物镜10倍以下中倍物镜20倍左右高倍物镜4065倍
根据像差矫正情况分为消物镜常用能矫正光谱中两种色光的色差的物镜和复色差物镜能矫正光谱中三种色光的色差的物镜价格贵使用少光学显微镜2物镜的主要参数
物镜主要参数包括放大倍数数值孔径和工作距离
①放大倍数是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值它指的是的比值而不是的比值例放大倍数为100×指的是长度是1μm的标本放大后像的长度是100μm要是以面积计算则放大了10,000倍
显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积
②数值孔径也叫简写NA 或A是物镜和聚光器的主要参数与显微镜的分辨力成正比干燥物镜的数值孔径为0.05-0.95香柏油的数值孔径为1.25
③工作距离是指当所观察的标本最清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离物镜的工作距离与物镜的有关物镜的焦距越长放大倍数越低其工作距离越长例10倍物镜上标有10/0.25和160/0.17其中10为物镜的放大倍数0.25为数值孔径160为镜筒长度单位mm0.17为盖玻片的标准厚度单位 mm10倍物镜有效工作距离为6.5mm40倍物镜有效工作距离为0.48mm 3物镜的作用是将作第一次放大它是决定显微镜性能的最重要的部件分辨力的高低光学显微镜分辨力也叫分辨率或分辨力的大小是用分辨距离所能分辨开的两个物点间的最小距离的数值来表示的在明视距离25cm之处正常人眼所能看清相距0.073mm的两个物点这个0.073mm的数值即为正常人眼的分辨距离显微镜的分辨距离越小即表示它的分辨力越高也就是表示它的越好
显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的决定的
当用普通的中央照明法使光线均匀地透过标本的明视照明法时显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA
式中d物镜的分辨距离单位 nm
λ照明光线波长单位 nm
NA 物镜的数值孔径
例如油浸物镜的数值孔径为1.25可见光波长范围为400700nm 取其平均波长550 nm则d=270 nm约等于照明光线波长一半一般地用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm
二目镜光学显微镜因为它靠近观察者的眼睛因此也叫接目镜安装在镜筒的上端
1目镜的结构
通常目镜由上下两组透镜组成上面的透镜叫做接目透镜下面的透镜叫做或场镜上下透镜之间或场镜下面装有一个光阑它的大小决定了视场的大小因为标本正好在光阑面上成像可在这个光阑上粘一小段毛发作为指针用来指示某个特点的目标也可在其上面放置目镜测微尺用来测量所观察标本的大小
目镜的长度越短放大倍数越大因目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比
2目镜的作用
是将已被物镜放大的分辨清晰的实像进一步放大达到人眼能容易分辨清楚的程度
常用目镜的放大倍数为516倍
3目镜与物镜的关系光学显微镜物镜已经分辨清楚的细微结构假如没有经过目镜的再放大达不到人眼所能分辨的大小那就看不清楚但物镜所不能分辨的细微结构虽然经过高倍目镜的再放大也还是看不清楚所以目镜只能起放大作用不会提高显微镜的分辨率有时虽然物镜能分辨开两个靠得很近的物点但由于这两个物点的像的距离小于眼睛的分辨距离还是无法看清所以目镜和物镜即相互联系又彼此制约
聚光器也叫集光器位于标本下方的聚光器支架上它主要由聚光镜和组成其中聚光镜可分为明视场聚光镜普通显微镜配置和聚光镜
1光镜的主要参数
数值孔径NA 是聚光镜的主要参数最大数值孔径一般是1.21.4数值孔径有一定的可变范围通常刻在上方透镜边框上的数字是代表最大的数值孔径通过调节下部可变光阑的开放程度可得到此数字以下的各种不同的数值孔径以适应不同物镜的需要有的聚光镜由几组透镜组成最上面的一组透镜可以卸掉或移出光路使聚光镜的数值孔径变小以适应低倍物镜观察时的照明光学显微镜2聚光镜的作用
聚光镜的作用相当于凸透镜起会聚光线的作用以增强标本的照明一般地把聚光镜的聚光焦点设计在它上端透镜平面上方约1.25mm处聚光焦点正在所要观察的标本上载玻片的厚度为1.1mm左右
可变光阑也叫光圈位于聚光镜的下方由十几张金属薄片组成中心部分形成孔其作用是调节光强度和使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应可变光阑开得越大数值孔径越大观察完毕后应将光圈调至最大
在可变光阑下面还有一个圆形的滤光片托架
说明在中学实验室只有教师用显微镜1600×或1500×才配有聚光器学生用显微镜640×或500×配的是旋转光栏紧贴在载物台下能做圆周转动的圆盘旋转光栏也称为遮光器光栏上有大小不等的圆孔叫直径分别为2361216mm,转动旋转光栏光栏上每个光圈都可以对正通光孔通过大小不等的光圈来调节的强弱
反光镜是一个可以随意转动的双面镜为50mm一面为平面一面为凹面其作用是将从任何方向射来的光线经通光孔反射上来平面镜反射光线的能力较弱是在光线较强时使用凹面镜反射光线的能力较强是在光线较弱时使用
反光镜通常一面是平面镜另一面是凹面镜装在聚光器下面可以在水平与垂直两个方向上任意
反光镜的作用是使由光源发出的光线或天然光射向聚光器当用聚光器时一般用不用时用当光线强时用平面镜弱时用凹面镜
观察完毕后应将反光镜垂直放置
显微镜的照明可以用天然光源或人工光源
光线来自天空最好是由白云反射来的不可利用直接照来的光
①对人工光源的基本要求有足够的发光强度光源发热不能过多
②常用的人工光源显微镜灯
安装在光源和聚光器之间作用是让所选择的某一波段的光线通过而吸收掉其他的光线即为了改变光线的光谱成分或削弱光的强度分为两大类滤光片和液体滤光器
七盖玻片和载玻片
盖玻片和载玻片的表面应相当平坦无气泡无划痕最好选用无色透明度好的使用前应洗净
盖玻片的标准厚度是0.17±0.02mm如不用盖玻片或盖玻片厚度不合适都会影响成像质量
载玻片的标准厚度是1.1±0.04mm一般可用范围是11.2mm若太厚会影响聚光器效能太薄则容易破裂显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分其作用是固定与调节光学镜头固定与移动标本等主要有镜座镜臂载物台镜筒物镜转换器与调焦装置组成
一镜座和镜臂
1镜座作用是支撑整个显微镜装有反光镜有的还装有照明光源
2镜臂作用是支撑镜筒和载物台分固定可倾斜两种
二载物台又称工作台镜台
载物台作用是安放载玻片形状有圆形和方形两种其中方形的面积为120mm×110mm中心有一个通光孔通光孔后方左右两侧各有一个安装压片夹用的小孔分为固定式与移动式两种有的载物台的纵横坐标上都装有游标尺一般读数为0.1mm游标尺可用来测定标本的大小也可用来对被检部分做标记
镜筒上端放置目镜下端连接物镜转换器分为固定式和可调节式两种机械筒长从目镜管上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离称为镜筒长度或机械筒长不能变更的叫做固定式镜筒能变更的叫做调节式镜筒新式显微镜大多采用固定式镜筒国产显微镜也大多采用固定式镜筒国产显微镜的机械筒长通常是160mm
安装目镜的镜筒有单筒和双筒两种单筒又可分为直立式和倾斜式两种双筒则都是倾斜式的其中双筒显微镜两眼可同时观察以减轻眼睛的疲劳双筒之间的距离可以调节而且其中有一个目镜有屈光度调节即视力调节装置便于两眼视力不同的观察者使用
四物镜转换器
物镜转换器固定在镜筒下端有34个物镜螺旋口物镜应按放大倍数高低顺序排列旋转物镜转换器时应用手指捏住旋转碟旋转不要用手指推动物镜因时间长容易使光轴歪斜使成像质量变坏
五调焦装置
显微镜上装有粗准焦螺旋和细准焦螺旋有的显微镜粗准焦螺旋与装在同一上大螺旋为粗准焦螺旋小螺旋为细准焦螺旋有的则分开安置位于镜臂的上端较大的一对螺旋为是粗准焦螺旋其转动一周镜筒上升或下降10mm位于粗准焦螺旋下方较小的一对螺旋为细准焦螺旋其转动一周镜筒升降值为0.1mm细准焦螺旋调焦范围不小于1.8mm1使用单筒显微镜时要养成用左眼观察的习惯因一般用右手画图观察时要两眼同时睁开不要睁一只闭一只因为这样易于疲劳为了训练学生习惯于两眼同时睁开观察可剪一块长约14cm宽约6cm的长方形硬纸片在靠近左端处挖一个直径比镜筒上端外径略小的圆孔把圆孔套在镜筒上段观察时两眼同时睁开利用纸片的右端挡住右眼的视线这样训练一段时间后就能习惯于两眼同时睁开然后把纸片去掉
2直筒显微镜的镜臂与镜座连接处是一个机械可用于调节镜筒的倾斜度便于观察镜臂不能过于后倾一般不超过40°但是在使用临时装片观察时禁止使用倾斜关节当镜筒倾斜时载物台也随之倾斜载玻片上的液体易流出尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用以免污损镜体
3目镜和物镜的使用
一般都是用一个放大倍数适中的目镜10×和最低倍的物镜开始观察逐步改用倍数较高的物镜从中找到符合实验要求的放大倍数
转换物镜时先用低倍镜观察调节到正确的工作距离成像最清晰如果进一步使用高倍物镜观察应在转换高倍物镜之前把物像中需要放大观察的部分移至视野中央将低倍物镜转换成高倍物镜观察时视野中的物像范围缩小了很多低倍物镜和高倍物镜基本同高调焦
通常认为使用任何一个物镜时有效放大倍数的上限是1000乘它的数值孔径下限是250乘它的数值孔径如40×物镜的数值孔径是0.65则上下限分别为=650倍和250×0.65≈163倍超过有效放大倍数上限的叫做无效放大不能提高观察效果低于下限的放大倍数则人眼无法分辨不利于观察一般最实用的放大倍数范围是500700乘数值孔径之间的数字
4油浸物镜的使用
使用油浸物镜时一般不要使用同高调焦同高调焦只适用于每台显微镜的原配物镜在使用低倍和高倍物镜时是一个极有利的方便条件但在使用油浸物镜时则受到一定限制一般地说用油镜观察未加盖玻片的标本片载玻片时利用同高调焦的安全度较大而对于有盖玻片的标本片要小心使用因为油浸物镜的工作距离很短在设计和装配时所考虑的同高是对标准厚度盖玻片的
用油浸物镜时只在标本片上滴观察完毕后要及时进行清洁工作如不及时进行香柏油粘上灰尘擦拭时灰尘粒子可能磨损透镜香柏油在中暴露时间长还会变稠变干擦拭很困难对仪器很不利擦拭要细心动作要轻油浸物镜前端先用干的擦镜纸擦一两次把大部分油去掉再用滴湿的擦镜纸擦两次最后再用干的擦镜纸擦一次标本片上的香柏油可用拉纸法即把一小张擦镜纸盖在香柏油上然后在纸上滴一些二甲苯趁湿把纸往外拉这样连续三四次即可干净一般不会损坏未加盖玻片的涂片标本擦净擦镜纸也要防尘一般在使用前将每页剪成8小块贮存在一个干净的小中用起来既节省又方便
5聚光器的使用方法
①使用聚光器的原因
当放大倍数增加时一方面由于放大倍数越高透镜数目越多被透镜吸收的光线也越多另一方面由于视场指的是所能看到被检标本的范围的亮度与放大倍数的成反比即放大倍数越高视场越暗为了得到足够的亮度必须安装聚光器把光线集中到所要观察的标本上
②观察时聚光器应处的高度
观察时要保证得到最好的观察效果聚光器的聚光焦点应正好落在标本上要实现这个条件就必须调节聚光器的高度当用平行光照明时聚光器的聚光焦点是在它上端透镜平面中心上方约1.25mm之处因此人们常常要求在观察时将聚光器上升到它上端透镜平面仅稍稍低于载物台平面的高度这样聚光就可能落到位于标准厚度载玻片上的标本上当使用比标准厚度薄的载玻片来承放标本时聚光器的位置要相应地降低一些而当使用过厚地载玻片时聚光焦点只能落在标本下方不利于精细的观察
③聚光器与物镜的配合
这里所谓的配合就是使聚光器和物镜这两者的数值孔径取得一致以更好的进行较为精细的观察假如聚光器的数值孔径低于物镜那物镜的部分数值孔径就浪费了从而达不到它的最高分辨力假如把聚光器的数值孔径大于物镜的数值孔径则一方面不能提高物镜的规定分辨力另一方面反会由于照明光束过宽使物象的清晰度下降聚光器与物镜配合的操作方法是在完成照明调焦操作后取下目镜直接向镜筒中看把聚光器下的可变光阑关到最小再慢慢地开大开到它的口径与所见视场的直径恰好一样大*然后按上目镜即可进行观察每转换一次物镜都要随着进行依次这样的配合操作有的聚光器可变光阑的边框上刻有表示开启口径的尺度可以根据刻度来进行配合
*注意如果是老师用的带有孔径光阑而不是光圈的显微镜应该将孔径光阑的数值孔径注意不是镜头的物理直径尺寸调整为物镜的数值孔径见物镜上正中标示如10×物镜可为0.30等的80%可以在最大分辨率与最大反差之间取得最好的平衡
历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展给人类的生活带来了空前的拓展在提倡科技创新的今天显微镜的使用已经成为中学生的一项基本技能掌握结构科学使用良好维护使之成为广大青少年探索未来世界的一个窗口为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明在显微镜初次安装和调试时就必须把照明光路系统调整好这是正确使用显微镜并获得正确可*结果的重要手段和最基本的要求此外正确掌握照明光路系统的调整是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段显微镜照明光路系统的调整主要有以下4项内容
1照明光源灯室在显微外的初步调整
① 首先将灯室的外壳打开压弹簧夹子将灯泡装入插座中安装时避免手指直接接触灯泡可用柔软的布或纸隔住以免灯泡上留有指纹等脏物影响灯泡的使用寿命
②把灯室摆在桌面上接通电源后用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔标有←→使灯丝投影在1-2m外的墙上将灯丝成像调至清晰然后调节灯的高低位置调节丝孔标有使灯丝位置高低适当再调节灯的左右位置调节螺丝孔标有使灯丝左右位置合适
2光源发光体灯丝在显微镜内位置的检验和校正　目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明这是调整库勒照明系统的前提条件需要的基本工具对中望远镜购置显微镜时已配备
① 拔掉灯库内的毛玻璃套筒把灯室装回显微镜上
②选用10×物镜开亮光源程序找样品并调焦清晰再换用40×物镜把样品调焦清晰40×物镜可以看清灯丝的全貌
③把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大
④拔掉其中一个目镜换上对中望远镜抓住白色部分另一手伸缩黑色接目镜就可在视野中看到灯丝像
⑤如灯丝位置不合适调孔把灯丝像沿水平方向调好调孔把丝像沿垂直方向调好直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像
⑥调整完毕后将毛玻璃套筒插回原位拔掉对中望远镜换回目镜作下一步调整以上所述照明光源灯室在显微镜外的调整和光源发光体在显微镜内位置的校验只需在显微镜初次安装调试及更换灯泡时进行平时使用显微镜时不能随意乱调乱动万一调乱时可按上述步骤调回原状
3库勒照明Kohler系统的正确调整　显微镜的正确调试主要工作之一是照明光路系统的调整而其中的关键是库勒照明系统的调整对于每一位使用显微镜的人员特别是作显微照像的人员来说应该对库勒照明系统的原理及其调整步骤有一定的了解和掌握才能充分发挥显微镜应有的功能拍出来的照片才能在效果上比较一致而又完善库勒照明系统的原理简单来说就是光源发光体上任意一点发出的光可以照明显微镜的视域范围而光源发光体上每一点所发出的光汇集起来在显微镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明调整库勒照明系统的目的是为了使所观察的视域能获得均匀而又充分的照明防止杂散光对照像系统造成影响或干扰以免照像时在底片形成灰雾高调整库勒照明系统的必要部件视场光阑可进行合轴调整的聚光镜系统
① 选用10×物镜和10×目镜
② 把聚光镜前端透镜摆进光路中孔径光阑调至适中的位置上不大不小再把聚光镜升到最顶的位置上聚光镜转盘调至明视野J位置
③ 把视场光阑调至最小0.1
④ 载物台上放上已封片的生物样品开亮光源调焦清晰
⑤ 视域中会出现一个局部照明的区域或亮斑这是视场光阑的模糊像在其中可以清晰地看到样品的细节在它之外是较暗的视域不一定能把样品的细节看得清楚
⑥把聚光镜微微地向下调使视野中的亮斑逐渐收小慢慢变成一个清晰的多边形象这便是视场光阑的清晰像
⑦一般情况下多边形象并不在视域中央需要调整聚光镜的一对调中螺丝把视场光阑多边形的像调至中央位置
⑧逐渐开大视场光阑使多边形象成为视域的内接多边形进一步核对调中的状况如对中不够理想继续微微调对中螺丝
⑨将视场光阑稍为再微微开大一些使它的多边形象恰好消失在视域的边缘上至此库勒照明系统调整完毕库勒照明系统调整好以后整个视域照明均匀拍摄的显微照片明亮清晰反差正常在日后使用过程中应特别注意 a. 视场光阑不可任意开大但可随物镜倍数的增大而将视场光阑收小随物镜倍数的减小而开大 b. 聚光镜的高低位置不准乱调否则会破坏已调整好的库勒照明系统 c. 使用10×以下物镜时要将聚光镜前端透镜摆出光路外使用10×或10×以上物镜时要将前端透镜摆入光路中 d. 关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题在实际使用过程中作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑但作显微照相时为了避免杂散光线对照相系统的干扰以便能拍摄到较完善的照片则应在使用每一个倍数的物镜时把视场光阑调节到正好消失于所观察的视域边上这是比较繁复的工作但又非做不可较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调整好并作好记号以后使用时根据记号直接调至相应的位置
4孔径光阑的正确使用　由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率使用时应掌握正确的使用方法过去由于对孔径光阑的认识不足往往把它当作是调节视野亮度的工具虽然调节孔径光阑在一定程度上可以改变视野的亮度但会直接影响成像的反差对比度及分辨率在使用过程中应尽可能避免为了发挥聚光镜孔径光阑的作用以便在观察时尤其在作显微照相时获得最佳分辨率在每换用一个倍数的物镜时在样品调焦清晰后需要调节孔径光阑使它的大小正好等于所用物镜数值孔径物镜孔径像的2/3 调整方法是用对中望远镜对焦于视野中黑色相差环上调节孔径光阑可以看到一个多边形的孔径光阑像然后调到等于物镜孔径像的2/3即介于黑色相差环外与圆形视域内之间为方便起见可把与各倍数物镜相对应的孔径光阑预先调整好并作好标记以免每次使用都要重新调整显微镜成像光路系统的调整是根据不同显微镜检术的需要而进行的所谓显微镜检术microscopy概括而言就是以显微镜观察样品时所使用的照明方法以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技术与方法以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调整方法
1透射光明视野
这是自显微镜发明以来最传统最普遍的应用方法基本部件 a. 物镜任何物镜都可作明视野观察 b. 聚光镜各种聚光镜均可最好配有孔径光阑调整方法在上述显微镜的库勒照明系统调整好后即可应用明视野法适用范围所有已染色的组织切片血液涂片等注意事项 a. 使用明视野方法观察时一定要将库勒照明系统调整好 b. 视场光阑不可任意开大使用10×10×以下和10×以上物镜时要将聚光镜前端透镜分别摆事实出和摆进光路中 c. 不可用聚光镜的孔径光阑来调节视野的亮度更不要乱调聚光镜的高低位置否则会降低显微镜的分辨率和破坏已调整好的库勒照明系统 d. 作显微照相时每换用一个倍数的物镜就要调节聚光镜的孔径光阑使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3
2透射光相差法
这是现代显微镜检术中的一种反差增强法基本部件相差物镜明视野与相差兼用的多用途聚光镜对中望远镜绿色滤光片
a. 在库勒照明系统调整好的基础上用明视野方法把样品调焦清晰
b. 把聚光镜转到Ph1对准转盘刻度线位置选用10×相差物镜换上待观察的透明样品
c. 拔掉其中一个目镜换上对中望远镜并调焦于视野中的两个相差环上物镜的黑色相差环和聚光镜的透光相差环
d. 视野中的两个相差环不一定重合调节聚光镜上的两个调节装置调整相差环左右位置的调节杆和调整前后位置的摩擦式转钮使透光环作前后左右移动而与黑环重合
e. 调整好后换回观察用目镜将绿色滤光片按入光路中即可观察到样品的相差像
f. 有20×和40×物镜观察时聚光镜应设在Ph2位置上用100物镜时聚光镜应设在Ph3位置上
适用范围适用于观察透明未染色或不能染色的样品如各种细胞活组织未染色或不染色的组织切片水生生物等
3微分干涉相衬法
为了克服相差法观察时样品细节像周围伴随有光晕会掩没掉本来应该看见的细节以及样品或组织切片厚度要求相当薄原则上下能厚于10?m等局限性利用双光束干涉的原理设计子微分干涉相衬法
a. 必须在库勒明系统已调好的基础上才能调好DIC方法
b. 先用10×物镜以明视野先确定好能把样品看清晰的物镜调焦位置
c. 把起偏器polarizer摆入照明光路中注意其取向应为东西方向
d. 把聚光镜转盘转到与10×物镜对应使用的位置上即DIC 0.30.4
e. 在物镜后方或物镜转换器上插入10×物镜使用的DIC插片DIC slider
f. 把检偏器analyser插入成像光路中注意其取向应为南北方
g. 换上待观察的透明样品开亮光源把样品调焦清晰
h. 调节DIC插片使微分干涉相衬的像达到最佳效果也就是浮雕效果最为明显
i. 同时可调节聚光镜的孔径光阑使反差的效果也达到最佳
j. 然后再细微调样品的细节可见样品中不同层面上的结构
k. 如果把补色器first order red retardation plate插入并同时调节DIC插片可在视野中看到不断变化的绚丽色彩红橙黄绿蓝紫粉红粉紫及金黄色都具有适用范围透明或不能染色的组织切片厚度可达100?m左右培养中的活组织和活细胞小生生物等
4落射光激发的荧光法incident-loght fluorescence Epi-FL
简称为落射荧光法是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法它将激发荧光用的光源改在物镜的上方光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察该方法较简便效率高50W的光源强度比透射荧光法的250W还强荧光方法是利用波长较短的紫外光紫光蓝紫光蓝光及绿光等去激发样品只要样品中含有可产生荧光的成分它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光不同物质只能吸改特定波长的激发光而释放的荧光也会有特定的波长因而用作特异性的鉴定十分有效如某些致病的细菌和螺旋体受紫外光激发后能发出它们特有的荧光很容易作出鉴定这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法某些物质自身不会吸收激发光或吸收后不能释放荧光但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光再释放出特定的荧光从而间接地鉴别出某种物质这称为间接荧光法上述荧光方法广泛应用于医学生物学及工业的特异性研究和鉴别上调整方法荧光显微镜或附有荧光部件的显微镜调整的方法大致相同
① 汞灯的安装
a. 打开包装取出汞灯将其小心安装在上散热帽上安装时注意手指不能直接接触灯管和散热帽的正面汞灯的封气口要对向散热帽的左侧或右侧
b. 把汞灯的上电极引张安装并固定在散热帽底面的小孔上再把汞灯的下电极及上电极引线另一端分别安装在灯座上各自的插孔中并固定
c. 锁紧散热片上的螺丝后把汞灯连同灯座及散热帽小心装入灯室中锁紧相应的螺丝再把灯座上的连线和插座插到汞灯电源后部专用的插座上
d. 详细的安装方法请参照有关说明书
② 汞灯灯室在显微镜外的初步调整
a. 接通汞灯电源让汞灯预热10-15min
b. 把汞灯灯室摆放在桌面上让汞弧投影到2-3m外的墙上划一条与灯室窗口中心线对地高度一样的水平线作为参考线
c. 转动灯室调焦旋钮使汞弧的像清晰地投影于墙上
d. 分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔把汞弧的像其反射像调成并排且尽量*近但不要重叠在一起
③汞灯汞弧在显微镜内位置的检验
a. 将汞灯照明光路系统中的视场光阑开到最大
b. 把荧光滤光片组推到蓝光激发的位置上以避免汞灯中的蓝光太刺眼
c. 把观察的样品或一块载玻片放在物台上盖上一张比盖玻片稍大且洁白的薄纸
d. 取下一个物镜使激发的蓝光经物镜转换器的空档照在白纸上白纸上会有一蓝色的圆形照明区域汞弧的像及其反射像都应该出现在这区域的中央部位否则可调节灯室调焦旋钮至最清晰然后分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔直至汞弧的像及其反射像并排在照明区域的中央位置
e. 调好之后把物镜装回去通过目镜可见白纸被蓝光激发后发射出的黄绿色荧光
f. 仔细调焦可看清白纸的纤维取去白纸样品上的荧光细节隐约可见而很容易调焦清晰
④汞灯使用注意事项　通常使用的为50W超高气压汞灯灯管内通有一对钨电极和液态汞室温下附在管壁上未点燃时管内气压很低在灯管的两电极间施加电压角发点燃后汞气化为汞蒸气形成汞弧而产生强光温度升高管内气压迅速升到10个大气压由于是高气压的气体放电必须了解其特性才能安全地使用汞灯
a. 汞灯接通电源后需要10-15min预热时间汞才能充分汽化并形成汞弧产生高亮度而稳定的激发光因此观察前要提早通电
b. 汞灯在使用过程中不要随意开关汞灯的电源
c. 关掉汞灯电源后必须等待15-20min待汞灯自燃冷却后才可再次接通电源违反这一操作规定时将会造成严重后果由于汞灯内的汞蒸气未完全液化汞蒸气内阻很小一旦通电在两电极间施加电压汞灯内形成强大的电流轻则烧断保险丝或烧毁汞灯电源中的扼流圈重则汞灯爆炸汞蒸气弥漫整个实验室造成工作人员中毒不仅损失了汞灯还会炸毁灯室内的集光-聚光部件
d. 汞灯的使用寿命一般只有300h使用得当可达600h使用寿命与开关的次数成反比应集中一批样吕作2-3h的观察汞灯价格及昂贵应珍惜使用
e. 汞灯寿命终结的标志是点燃困难灯管发黑
5暗视野法dark field
许多透明或半透明的样品如细菌微生物细胞内的精细结构及结晶体的内含物等在明视野显微镜中不容易看清楚如果采用暗视野法就可以大大提高样品的可视度以暗视野法所看到的是衬托在黑暗视野背景中发亮的样品轮廓及其细节普遍光学显微镜的最高分辨率为0.2μm而暗视野显微镜虽然对样品的细节构造分辨不清楚但却可看到0.004μm以上微细颗粒的存在即可以看到特别适合用来观察微细的颗粒与细菌等调整方法暗视野法的主要必需部件是暗视野聚光镜使用时须先用明视野聚光镜把库勒照明系统调整好换上暗视野聚光镜时要把载玻片样品移开将浸没油滴在聚光镜顶部再把样品载玻片搁在物台上浸没油便充填在两者之间这种聚光镜须与装有可变光阑的100×油镜配用另一种中倍率干式暗视野聚光镜可与中倍率的物镜配用这种聚光镜具有中央光挡照明光只能透过光档与聚光镜边缘之间的透光环才能进入聚光镜内对于配备齐全的与编号为Ph3物镜配用的相差聚光镜相差环可以和10×及10×以下的相差物镜配用而形成低倍率的暗视野效果显微镜是利用凸透镜的放大成像原理将人眼不能分辨的微小物体放大到人眼能分辨的尺寸其主要是增大近处微小物体对眼睛的张角视角大的物体在视网膜上成像大用角放大率M表示它们的放大本领因同一件物体对眼睛的张角与物体离眼睛的距离有关所以一般规定像离眼睛距离为25厘米处的放大率为仪器的放大率显微镜观察物体时通常视角甚小因此视角之比可用其正切之比代替
显微镜放大原理光路图显微镜由两个会聚透镜组成光路图如图所示物体AB经物镜成放大倒立的实像A1B1A1B1位于目镜的物方焦距的内侧经目镜后成放大的虚像A2B2于明视距离处随着现代生物技术的发展和人们对显微镜要求的提高单一的光学显微成像系统已经远远不能满足人们显微摄显微镜摄像头与显微镜接口连接影的要求数码显微镜的面市标志着光学显微镜从此进入到一个新的数码时代数码显微镜不仅结合了光学显微镜良好的成像特点更将其与先进的光电转换技术液晶屏幕技术完美地结合使显微镜在具有显微观察本领的同时更实现了显微图像的数字化存储和传输
然而数码显微镜高昂的成本并没有使其得到广泛的应用一种新型的显微数码产品显微数字摄像头也随之产生显微数字摄像头作为一种专用的显微数字相机能够方便地链接到任意的显微镜上实现光学显微镜向数码显微镜的转化
作为光学显微镜的必备配件显微数字摄像头也根据不同的需要分为很多个不同的等级有的比较适合对图像的要求比较高的有的比较适合一般化的需求作为一种方便快捷的显微摄像系统显微数字摄像头将得到极大的应用
光学显微镜的配件有目镜物镜和光源等等当然随着科技的发展光学显微镜逐渐也配备了摄像系统这样就可以在显示器上显示出来了观看的时候也比较方便了显微镜常用配件－C接筒[2]
另外光源显微镜的光源也比较重要配备的时候光源有环形光源也有夹式的光源 光学显微镜的底座也不尽相同有的是塑料材质的有的是合金的好一点的是合金的材质合金的不容易变形放大的倍数也不大一样有的可以连续变倍有的只有一个倍数或者两个倍数一实验时要把显微镜放在桌面上稍偏左的位置镜座应距桌沿 6～7 cm左右
二打开光源开关调节光强到合适大小
三转动物镜转换器使低倍镜头正对载物台上的通光孔先把镜头调节至距载物台1～2cm左右处然后用左眼注视目镜内接着调节聚光器的高度把孔径光阑调至最大使光线通过聚光器射入到镜筒内这时视野内呈明亮的状态
四将所要观察的玻片放在载物台上使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央然后用标本夹夹好载玻片
五先用低倍镜观察物镜10X目镜10x观察之前先转动粗动调焦手轮使上升物镜逐渐接近玻片需要注意不能使物镜触及玻片以防镜头将玻片压碎然后左眼注视目镜内同时右眼不要闭合要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯以便在观察的同时能用右眼看着绘图并转动粗动调焦手轮使载物台慢慢下降不久即可看到玻片中材料的放大物像
六如果在视野内看到的物像不符合实验要求物像偏离视野可慢慢调节载物台移动手柄调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反如果物像不甚清晰可以调节微动调焦手轮直至物像清晰为止
七一般具有正常功能的显微镜低倍物镜和高倍物镜基本齐焦在用低倍物镜观察清晰时换高倍物镜应可以见到物像但物像不一定很清晰可以转动微动调焦手轮进行调节
八在转换高倍物镜并且看清物像之后可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低使光线符合要求一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时视野要稍变暗一些所以需要调节光线强弱
九观察完毕应先将物镜镜头从通光孔处移开然后将孔径光阑调至最大再将载物台缓缓落下并检查零件有无损伤特别要注意检查物镜是否沾水沾油如沾了水或油要用镜头纸擦净检查处理完毕后即可装箱[3]一必须熟练掌握并严格执行使用规程,按照严格的流程和说明书来操作显微镜
二取送显微镜时一定要一手握住弯臂另一手托住底座显微镜不能倾斜以免目镜从镜筒上端滑出取送显微镜时要轻拿轻放
三观察时不能随便移动显微镜的位置
四凡是显微镜的光学部分只能用特殊的擦镜头纸擦拭不能乱用他物擦拭更不能用手指触摸透镜以免汗液玷污透镜
五保持显微镜的干燥清洁避免灰尘水及化学试剂的玷污
六转换物镜镜头时不要搬动物镜镜头只能转动转换器
七切勿随意转动调焦手轮使用微动调焦旋钮时用力要轻转动要慢转不动时不要硬转
八不得任意拆卸显微镜上的零件严禁随意拆卸物镜镜头以免损伤转换器螺口或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦
九使用高倍物镜时勿用粗动调焦手轮调节焦距以免移动距离过大损伤物镜和玻片
十用毕送还前必须检查物镜镜头上是否沾有水或试剂如有则要擦拭干净并且要把载物台擦拭干净然后将显微镜放人箱内并注意锁箱
(十一显微镜的保存最好在干燥清洁的环境中避免灰尘以及化学品玷污一正确安装的问题
使用显微镜前首先要把显微镜的目镜和物镜安装上去目镜的安装极为简单主要的问题在于物镜的安装由于物镜镜头较贵重万一学生安装时螺纹没合好易摔到地上造成镜头损坏所以为了保险起见强调学生安装物镜时用左手食指合中指托住物镜然后用右手将物镜装上去这样即使没安装好也不会摔到地上
二正确对光的问题
对光是使用显微镜时很重要的一步有些学生在对光时随便转一个物镜对着通光孔而不是按要求一定用低倍镜对光转动反光镜时喜欢用一只手往往将反光镜扳了下来所以教师在指导学生时一定要强调用低倍镜对光当光线较强时用小光圈平面镜而光线较弱时则用大光圈凹面镜反光镜要用双手转动当看到均匀光亮的圆形视野为止光对好后不要随便的移动显微镜以免光线不能准确的通过反光镜进入通光孔
三正确使用准焦螺旋的问题
使用准焦螺旋调节焦距找到物象可以说是显微镜使用中最重要的一步也是学生感觉最为困难的一步学生在操作中极易出现以下错误一是在高倍镜下直接调焦;二是不管镜筒上升或下降眼睛始终在目镜中看视野三是不了解物距的临界值物距调到2～3厘米时还在往上调而且转动准焦螺旋的速度很快前两种错误结果往往造成物镜镜头抵触到装片损伤装片或镜头而第三种错误则是学生使用显微镜时最常见的一种现象针对以上错误教师一定要向学生强调调节焦距一定要在低倍镜下调先转动粗准焦螺旋使镜筒慢慢下降物镜靠近载玻片但注意不要让物镜碰到载玻片在这个过程中眼睛要从侧面看物镜然后用左眼朝目镜内注视并慢慢反向调节粗准焦螺旋使镜筒缓缓上升直到看到物像为止同时向学生说明一般显微镜的物距在1厘米左右所以如果物距已远远超过1厘米但仍未看到物象那可能是标本未在视野内或转动粗准焦螺旋过快此时应调整装片位置然后再重复上述步骤当视野中出现模糊的物象时就要换用细准焦螺旋调节只有这样才能缩小寻找范围提高找到物象的速度
四物镜转换的问题
使用低倍镜后换用高倍镜学生往往喜欢用手指直接推转物镜认为这样比较省力但这样容易使物镜的光轴发生偏斜原因是转换器的材料质地较软精度较高螺纹受力不均匀很容易松脱一旦螺纹破坏整个转换器就会报废教师应指导学生手握转换器的下层转动扳转换物镜
五光学玻璃清洗的问题
光学玻璃用于仪器的镜头棱镜镜片等在制造和使用中容易沾上油污水湿性污物指纹等影响成像及透光率清洗光学玻璃应根据污垢的特点不同结构选用不同的清洗剂使用不同的清洗工具选用不同的清洗方法清洗镀有增透膜的镜头如照相机幻灯机显微镜的镜头可用20%左右的酒精和80%左右的乙醚配置清洗剂进行清洗清洗时应用软毛刷或棉球沾有少量清洗剂从镜头中心向外做圆运动切忌把这类镜头浸泡在清洗剂中清洗清洗镜头时不要用力擦拭否则会损伤增透膜损坏镜头
清洗棱镜平面镜的方法可依照清洗镜头的方法进行
使用上述清洗剂也能清洗光学玻璃上的油脂性雾水湿性雾和油水混合性雾其清洗方法和清洗镜头的方法相似
光学玻璃表面发霉是一种常见现象当光学玻璃生霉后光线在其表面发生散射使成像模糊不清严重者将使仪器报废光学玻璃生霉的原因多是因其表面附有微生物孢子在温度湿度适宜又有所需营养物时便会快速生长形成霉斑对光学玻璃做好防霉防污尤为重要一旦产生霉斑应立即清洗注意干燥
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