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2014年电大《园艺植物育种学》试题库参考答案小抄.doc5页
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电大《园艺植物育种学》试题库－题
一、名词解释：
1、园艺植物育种学：园艺植物育种学是研究选育与繁殖园艺植物优良品种的原理和方法的科学。
2、育种目标：育种目标就是对所要育成品种的要求，也就是所要育成的新品种在一定自然、生产及经济条件下的地区栽培时，应具备的一系列优良性状的指标。
3、种质资源：把具有种质并能繁殖的生物体同成为种质资源。
4、引种：引种驯化简称为引种，就是将一种植物从现有的分布区域（野生植物）或栽培区域（栽培植物）人为的迁移到其他地区种植的过程；也就是从外地引进本地尚未栽培的新的植物种类、类型和品种。
5、遗传力：遗传力就是亲代性状值传递给后代的能力大小。
6、选择反应：数量性状的选择效果，决定于选择差与遗传力的乘积，称为选择反应。
7、芽变：芽变是指发生在芽内分生组织细胞中的突变，属于体细胞突变的一种。
8、群体品种：群体品种是指群体遗传组成异质，个体杂合，其品种群体可以表现差异，但必须有一个或多个性状表现一致，与其它品种相区分。
9、有性杂交育种：又称组合育种，它是通过人工杂交的手段，把分散在不同亲本上的优良性状组合到杂种中，对其后代进行多代培育选择，比较鉴定，以获得遗传性相对稳定、有栽培利用价值的定型新品种的育种途径。
10、两亲杂交：两亲杂交是指参加杂交的亲本只有两个，又称成对杂交或单交。
11多亲杂交：多亲杂交是指三个获三个以上的亲本参加的杂交，又称复合杂交或复交。
12回交：杂交第一代及其以后世代与其亲本之一再进行杂交称回交。
13、添加杂交：多个亲本逐个参与杂交的方式称添加杂交。
14、单交种：两个自交系之间的杂种一代称
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(Cruciferae)(Brasscica)
21Bcaulo—rapa Pasq
& 32Brapa L
3Bnapiformis
54 Boleracea&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
Lvarcapitala L
55Boleraea Lvarbotrylis L
&& 6 6Bpekinensis RuPr
&& 6 7Bchinensis L
BCaulo~apa
4Bnapiformis
5Boleracea Lvarcapitala L
5Boleraea Lvarbotrylis L
6Bpekinensis
&&& Bchinensis L
446(42)l2CruciferaeBrassica
pekinensis& Rupr遗传学实验（第二版）
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/ 遗传学实验（第二版）　
（ 1 ） NaCl
8.00 克 KCl O.20 克 Na2HPO4
1.15 克 KH2PO4
0.20 克三重蒸馏水 800 毫升（ 2 ） CaCl2 · 2H2O 0.17 克三重蒸馏水 100 毫升（ 3 ） MgCl2 · 6H2O 0.10 克三重蒸馏水 100 毫升（ 4 ） 2mol/Lhepesbuffer 0.47 克/毫升（ 5 ） phenolred 0.0012 克/毫升工作液：（1）＋（2）＋（3）＋2 毫升（4）＋1 毫升（5），过滤灭菌。7.salineG 缓冲液（ 1 ） glucose
1.10 克 NaCl 8.00 克 KCl 0.40 克 Na2HPO4 · 7H2O
0.29 克 KH2PO4
0.15 克三重蒸馏水 900 毫升（ 2 ） phenolred 0.0012 克/毫升（ 3 ） SolVI10 倍浓度MgSO4 1.54 克/1000 毫升CaCl2 · 2H2O 0.16 克/1000 毫升将上面两种浓液混和。　工作液：900 毫升（1）＋1 毫升（2）＋100 毫升（3），8—10 磅湿热灭 菌 30 分钟。（二）细胞融合（见图 27-1，A）1.仓鼠细胞 Wg-3h－－HGPRT-　细胞经 Trypsin-EDTA 消化、计数、得 1×106 细胞，加入 0.2 毫升 PFBS 成细胞悬液，置 4℃待用。2.人体淋巴细胞在离体条件下不加 PHA 不会贴壁生长。　自人体抽取 3 毫升血样置圆底离心管，加入 15 毫升白细胞分离液，管口 加盖，放在 37℃水浴锅中 15 分钟，离心，1000rpm10 分钟，吸去上清液，如 上述重复 2—3 次，至底壁有一层白细胞，加入 Hanks 液，计数，离心。加入0.2 毫升 PFBS 使成细胞悬液，置 4℃待用。3.病毒促融（见图 27-1，B、C）　（1）病毒 0.2 毫升（以融合率为依据用 PFBS 稀释），置预热 8W 紫外灯 下，灯距为 5 厘米，灭活 3 分钟。　（2）0.2 毫升 1×106 仓鼠细胞加 0.2 毫升 3×106 人体淋巴细胞，混合于 圆底离心管中，然后加入 0.1 毫升灭活病毒悬液。置碎冰中 20—30 分钟，并 不断振荡。后入 37℃水浴锅中 30 分钟。　　病毒促融因子主要在病毒外壳，是卵磷脂的作用，在 4℃中细胞被病毒吸 附和凝集，在 37℃中病毒颗粒吸附部位细胞膜受到损伤，细胞之间穿孔，接 着细胞损伤部位修复，使相邻近细胞相互连接，随后球形细胞形成。4.PEG 促融1×106 仓鼠细胞加 3×106 人体淋巴细胞混和置圆底离心管中，离心，1000rpm5 分钟，去上清液，用振荡器混和细胞，加入 0.5 毫升 50％PEG，迅 速搅匀，约处理 30 秒，立即加入 10 毫■■升 GKN 缓冲液，离心，1000rpm5 分钟，如上述洗 2—3 次，加入完全培养基，分种细胞。 余下步骤同病毒促融。　近年来已广泛应用化学药物 PEG 进行促融，PEG 的作用是清除质膜的脂类 保护衣，招致细胞紧密接触，脂类分子重排促使胞质的合并，最后稳定已合 并的细胞。（三）杂种细胞选择　1.细胞融合后，以 1×105 或 5×104 细胞数接种于小方瓶中。直接加入 HAT 选择培养液，若接种细胞数稀，死细胞不多，中间不用换液。置 37℃直至杂 种克隆出现。也可在融合后，接种细胞于完全培养液中，生长二天后，换入 HAT 选择培养液。由于 HAT 选择培养液中有氨甲喋呤的存在阻断了核酸的从头合成，但正常细胞具有 HGPRT 酶和 TK 酶，可以利用外源的次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）合成核酸，由于 Wg3-h 细胞缺失 HGPRT 酶，在 HAT 选择培养液中不能生 长，而人体淋巴细胞在体外又不能正常增殖，因此在 HAT 培养液中生长的只 能是由人体淋巴细胞和中国仓鼠细胞形成的杂种细胞。2.按单细胞克隆分离法排选形态一致的克隆，培养在完全培养液中，传代后，一部分细胞冻存，一部分细胞进行生化及细胞学鉴定。（四）杂种细胞鉴定1.Giemsa11 分化染色　按染色体分化技术中的 Giemsa 分化染色步骤操作，在显微镜高倍目镜下 初检有否差别染色出现，如果看到有淡蓝色的染色体和深品红色的染色体， 可初步确定该克隆细胞为杂种细胞。2.G 带鉴定　按染色体分化染色技术中 G 带技术操作，在显微镜高倍目镜下检查是否有 人的染色体，若有的，就可以进一步摄像，排队染色体，鉴别有哪几号人的 染色体。3.酶的检定（1）样品制备①Trypsin-EDTA 消化细胞，加入 Hanks 液，离心，800rpm5 分钟。②去上清液，加入 2 毫升 Hanks 液，计数细胞。③分装细胞悬液在离心管中，每管 2—4×106 细胞，离心，800rpm5 分钟。　④弃上清液，加入 0.75 毫升 salineG，在振荡器上搅匀细胞，移入 Eppendorf 离心管，离心，12000rpm2 分钟。　⑤弃上清液，用滤纸尽量吸干，加 0.03 毫升三重蒸馏水，使最终细胞浓 度为 108/毫升。　⑥用液氮或干冰和 37℃水浴进行细胞冻融，连续 3—5 次，在低倍目镜下 检查，没有细胞形态，呈一片胞质，离心，12000rpm4 分钟。　⑦取上清液作为电泳的样品。（2）醋酸纤维薄膜电泳（cellogelelectrophoresis）①处理醋酸纤维薄膜　将 cellogel 置 30％甲醇中保存，用时取出将它用卫生纸吸干，浸入电泳 缓冲液中 10 分钟，重复二次，即可点样。②电泳缓冲液0.04mol/L 巴比妥钠，用 10mol/LNaOH 调至 pH10。将缓冲液倒电泳槽中（Gelmantank），若检测 G6PD 在阴极一端加 10 毫克辅酶Ⅱ（NADP）。③点样 将薄膜置电泳槽桥上，表面向上，薄膜要铺平，然后用点样器将样品点上。④走电泳电压调至 140V，电流 10A，电泳 2—2.5 小时。（3）染色——检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD、X 染色体）①0.2mol/LTris/ml 缓冲液，pH8.025 毫升②glucose-6-phosphale（Na2salt）10 毫克最终浓度为 0.6mmol/L。③0.2mol/LMgCl2。④NADP（Na2salt）5 毫克溶于 1 毫升蒸馏水。⑤噻唑兰（MTT）7.5 毫克溶于 1.5 毫升蒸馏水。⑥吩嗪二甲硫酸酯（PMS）5 毫克溶于 1 毫升蒸馏水。⑦1％琼脂　混和①至⑥，等量染色液加等量 37℃琼脂，将混和琼脂后的染色液倒入大 培养皿，将薄膜表面向下平铺于染液上，加盖置 37℃，保温 30 分钟，取出 观察在薄膜上有蓝色带型见图 27-1、D 即已染好，取出用 4％冰醋酸清洗后， 保存在 4％冰醋酸中，待摄影。（4）染色——检测乳酸脱氢酶（LDH，11、12 染色体）（见图 27-1，C）①tris（1mol/L）-HCl-EDTA（0.004mol/L）12.11 克 Tris，0.149 克 Na2EDTA，100 毫升蒸馏水，pH8.6。②乳酸钠（0.4mol/L）③辅酶 I（NAD）10 毫克/毫升④NBT（nitrobluetetriezolium）2.0 毫克/毫升⑤PMS0.4 毫克/毫升⑥1％琼脂混和①5 毫升、②5 毫升、③2 毫升、④2 毫升、⑤2 毫升，然后加以等量37℃1％琼脂，染色同 G6PD。五、实验结果　细胞融合、选择、检定，用 Wg3-h 做亲本可以得到含有不同人体染色体的 杂种克隆，用 CHO-K1 做亲本可以得到只留下一条标记的染色体。用前者可以 做含有人的不同数目染色体的分布板（panel），结合酶的分析进行基因定位。 用后者可以进行单条人体染色体上的基因定位，作 DNA 顺序分析。用细胞融 合这个技术还可以进行 PCC（prematurechromosomecondensation）的研究， 应用于细胞周期及预测白血病患者的发病率，以及单克隆抗体等研究。六、问题　1.试画一张染色体的分布板，结合酶的分析来进行定位（定 X 染色体上的 G6PD）。2.请告诉 G6PD 酶和 LDH 酶的酶谱带型应是怎样的？ 参考文献附录二（一）溶液配制　1.1％酚红：称取酚红 1 克置于研钵内。量取 0.1mol/LNaOH28 毫升。逐滴 加入研钵内尽量磨细，溶解后把 28 毫升 0.1mol/LNaOH 剩余的全部加入。加 双蒸水至 100 毫升，4℃保存。2.Hanks 液 10×甲液：Na2HPO4·2H2O0.6 克，KH2PO40.6 克，KCl4.0 克，MgSO4·7H2O2.0克，葡萄糖 10.0 克，NaCl80.0 克，以上药品溶于 900 毫升双蒸水中。 乙液：CaCl2·H2O1.4 克，单独溶于 100 毫升双蒸水中。 甲、乙二液都溶解后就混在一起，成为母液，用时稀释。取 100 毫升母液，加 900 毫升双蒸水，加 2 毫升 1％酚红。高压消毒。8 磅 20 分钟。3.D-Hanks 液 10×（即无 Ca2+、Hg2+的 Hanks 液）。NaCl80.0 克，KCl4.0 克，Na2HPO4·12H2O0.12 克，KH2PO40.6 克，葡萄糖10.0 克，以上药品溶于 1000 毫升双蒸水中，使用时同 Hanks 液一样。4.Trypsin-EDTA 液　Trypsin（Difco1∶250）0.5 克，EDTA0.2 克，1000 毫升 D-Hanks（含有 2 毫升 1％酚红）。用 50％的 Na0H 调至 pH7.5 过滤灭菌。（二）透析血清的制备1.置透析袋于温水中使其变软。　2.取灭活小牛血清 200 毫升放入透析袋中，透析袋二头用橡皮筋扎紧，使 其勿漏。3.放入塑料桶（忌铁器），然后在 4℃冰房中，给以流水透析 24 小时，并在水桶中通以空气。4.换入 SoluⅡ（NaCl148.0 克，KCl5.7 克，Na2HPO4·7H2O5.8 克，KH2PO41.66克，1000 毫升水，用时 1∶20 稀释），将水桶置磁力搅拌器以上，水桶内放 入磁芯，12 小时后更换一次 SoluⅡ。5.用微孔薄膜过滤，孔由大到小，1.2μ→0.45μ→0.30μ→0.22μ，只有最后一步 0.22μ的滤膜。滤器需高压消毒过的。6.无菌检查，-80℃保存。（邱信芳）实验二十八植物染色体压片法
一、实验原理 植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固 定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂 各时期的细胞和染色体。
二、实验目的 根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组 型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。
三、实验材料 大蒜（Aillumsativum）、洋葱（Aillumcepa）的鳞基或蚕豆（Viciafaba） 的种子。四、实验器具和药品　1.用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子， 解剖针，毛边纸。　2.药品：无水酒精，70％酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠， 碱性品红，石碳酸，甲醛，山梨醇，纤维素酶，果胶酶，中性树胶或油派胶（Euparal），二甲苯。卡诺固定液的配制：用 3 份无水酒精，加入 1 份冰醋酸（现配现用）。 酶液的配制：以 0.1mol/L 醋酸钠为溶剂，配成纤维素酶（2％）和果胶酶（0.5％）的混和液。 染色液的配制：配方Ⅰ.石碳酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液 A 和 B。 母液 A：称取 3 克碱性品红，溶解于 100 毫升的 70％酒精中（此液可长期 保存）。　母液 B：取母液 A10 毫升，加入 90 毫升的 5％石碳酸水溶液（2 周内使用）。 石碳酸品红染色液：取母液 B45 毫升，加入 6 毫升冰醋酸和 6 毫升 37％的 甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂 比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方Ⅱ，称改良石碳酸品红，可以 普遍应用于植物染色体的压片技术。配方Ⅱ：改良石碳酸品红取配方Ⅰ.石碳酸品红染色液 2—10 毫升，加入 90—98 毫升 45％的醋酸和1.8 克山梨醇（sorbitol）。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染 色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。五、实验说明　1.根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难 以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。2.植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根， 掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。3.前处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理 3—4 小时。可处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。　4.解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分 解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。　（1）酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色 体计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解和压片后， 都呈单细胞，但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。　（2）酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过 解离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的 压片，使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质，致使多项制片措施直 接作用于染色体。六、实验步骤（一）将大蒜或洋葱的鳞基，置于盛水的小烧杯上，放在 25℃温箱中，待根长到 2cm 左右时，在上午九时摘下根尖，放到对二氯苯饱和水溶液，或 0.02％秋水仙素溶液中，浸泡处理 3—4 小时。　（二）经过前处理的根尖，再放到卡诺固定液中，固定 24 小时。固定材 料可以转入 70％酒精中，在 4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。（三）这里介绍两个解离方法，可以根据实验需要选择使用。1.酸解：从固定液中取出大蒜或洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0.1mol/LHCl 中，在 60℃水浴中解离 8—10 分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染 色板上，加上几滴改良石碳酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。　2.酶解：取大蒜或洋葱的固定根尖，放在 0.1mol/L 醋酸钠中漂洗，用刀 片切除根冠以及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把根尖分生组织切成 2—3 片），把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶（2％）和果胶酶（0.5％） 的混合液中，在 28℃温箱中解离 4—5 小时，此时组织已被酶液浸透而呈淡 褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上 0.1mol/L 醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再换入 45％醋酸。 酶解后的根尖，如作分带或姊妹染色单体交换，可用 45％醋酸压片，如作 核型分析或染色体计数等常规压片，可放在改良石碳酸品红中染色，经过酶 处理的组织染色速度快。（四）压片，把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长区部分截去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。一个解离良好的材料，只 要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用 毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在 这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相， 要达到这个目的，必需掌握以下几点：1.压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。　2.用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色 体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。（五）封片。把压好的玻片标本，放在干冰或冰箱结冰器里冻结。然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上 盖玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封 片。拍摄根尖染色体的分裂相。七、结果参考文献实验二十九植物染色体组型分析
一、实验原理 各种生物的染色体数目是恒定的。大多数高等动植物是二倍体 （diploid）。也就是说，每一个体细胞含有两组同样的染色体，用 2n 表示。 其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。每一个配子带有 一组染色体，叫做单倍体（haploid），用 n 表示。两性配子结合后，具有两 组染色体，成为二倍体的体细胞。如蚕豆的体细胞 2n=12，它的配子 n=6，玉 米的体细胞 2n=20，配子 n=10。水稻 2n=24，n=12。有些高等植物还是多倍 体。染色体在复制以后，纵向并列的两个染色单体（chromatids），往往通过着丝粒（centromere）联在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的。由于 着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂（arms），造成中 间着丝粒，亚中间着丝粒、亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。 此外，有的染色体还含有随体或次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一 个物种的染色体组型。染色体组型分析是细胞遗传学、现代分类学和进化理 论的重要研究手段，也是一种简便的方法。二、实验目的　1.初步掌握植物染色体制片技术、有条件的实验室可以学习染色体显微摄 影及放大技术（参考文献 3）。2.分析染色体组型计算有关数据。 三、实验材料　蚕豆、玉米、黑麦或水稻的根尖（或木本植物的茎尖），或幼嫩花蕾，经 固定，染色，压片（方法参见实验二十八），显微摄影，得染色体照片。也 可以由实验室提供染色体制片或放大照片。　　　　　　　　　　　　四、实验器具和药品 显微镜，测微尺，毫米尺，镊子，剪刀，绘图纸。如无现成的染色体照片 需备摄影显微镜以及有关摄影器材。五、实验说明　植物染色体组型分析方法分为两大类，一类是分析体细胞有丝分裂时期的 染色体数目和形态。另一类是分析减数分裂时期的染色体数目和形态，均能 得到染色体组型。各染色体的长臂与短臂之比称为臂率。臂率为 1.0—1.7 的归为中间着丝粒染色体，用（M）表示。1.7—3.0 的归为亚中间着丝粒染色体，用（SM）表示。3.0—7.0 的归为亚端部着丝粒染色体，用（St）表示。7.0—更大的归为端部着丝粒染色体，用（Ot）表示。　用 SAT 代表具随体的染色体，计算染色体长度时，可以包括随体也可以不 包括，但均要注明。六、实验步骤　（一）有丝分裂时期染色体组型分析 萌发的种子的根尖，或木本植物的茎尖（特别是倒数第二、第三张嫩叶， 通过固定、染色、压片等可以进行组型分析，但染色体分散程度差而且形状 不固定，需要制备较多的片子，才能得到满意的结果。而这些材料通过“去 壁低渗法”（见实验二十八）制备染色体，可以较快得到优良染色体组型的 制片及照片。　1.测量：若同染色体制片标本进行直接测量时，必须利用显微镜与测微 尺，事先要用台微尺对目微尺的单位长度进行标定后再进行工作，仅对染色 体长度较大的标本适合。一般标本还是先行拍照放大，后进行测量，可得较 好数据。根据显微测量或放大照片测量、记录染色体形态测量数据如下：长臂(q )（1） 臂率 ?短臂( p)短臂（2）着丝粒指数 ?该染色体长度×100（3）总染色体长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和每一个染色体的长度（4）相对长度 ?总长度×100（5）例表（表格于实验结果中）　（6）配对：根据测量数据，即染色体相对长度、臂率、着丝粒指数、次 缢痕的有无及位置、随体的形状和大小等进行同源染色体的剪贴配对。　（7）染色体排列：染色体对从大到小，短臂向上、长臂向下，各染色体 的着丝粒排在一条直线上。有特殊标记的染色体（如含有随体的）以及性染 色体等可单独排列。　（8）翻拍或绘图。完成上述步骤的染色体剪贴，可以通过翻拍摄影或描 图成为染色体组型图。 高等植物属异源多倍体种类的较多，进行组型分析时，不完全根据染色体 的大小进行排列，而事先要根据系统发育的来源进行分组，然后各组按大小 进行编排。例如，人工培育的小黑麦。来自小麦的染色体组是 AABBDD，来自 于黑麦的染色体组是 RR，组型分析时不仅应将 RR 分开，而且小麦本身是个 天然的异源多倍体，又应分成 AA、BB、DD 组几组进行分析。经常见到的植物 如棉花、烟草、马铃薯以及许多果树、花卉均具有多倍体品种，分析时应特 别注意。（二）减数分裂时期的染色体　在减数分裂过程中，染色体的形态和行为发生了一系列的变化。特别是减 数分裂Ⅰ的粗线期（pachytene），它是染色体组型分析的良好时期。这时同 源染色体已经联会。而每一条染色体包含着 4 条染色单体即成为二价体，这 时，染色体个体形态明显，分散度好，除有稳定的测量长度，着丝粒位置， 有无随体等特点之外，某些材料（如玉米）的染色体在一定位置上分布着染 色质纽结（knob），也是染色体特性的标志。 此外，许多植物在减数分裂时，在同一个花药中的细胞具有比较好的细胞 分裂同步性，给分析带来了方便。 根据减数分裂Ⅰ粗线期染色体联会的情况。可以了解产生杂种双亲的亲缘 关系。在物种起源和新种合成和杂种优势利用中，有一定的意义。 玉米、百合、鸭跖草的花药，是利用减数分裂研究染色体组型较好的材料。 新鲜固定的蚕豆、豌豆的花蕾也可以利用。本实验选用一种材料进行，方法 同（一）。七、实验结果　列表并文字、图片说明，两种组型分析法，各分析一种植物所得结果。也 可用两种方法同时分析一种植物，比较它们的结果。参考文献实验三十植物染色体分带技术一、实验原理　染色体分带技术已在人类及动物材料的研究中取得了显著的成果，人类的 染色体已有国际标准化带型。70 年代初以来，人们把分带技术引入到植物染 色体研究中来，形成了各种植物染色体的分带技术。 事实证明，几乎所有的植物染色体都能显带，植物染色体显带原理和动物 染色体显带原理相似，是由于特殊的染料和染色体上的某些结构成份发生特　异反应而产生的。因为染料与处理条件的不同可产生不同的带型，因此有 C 带、N 带、G 带等不同的技术，到目前为止，植物染色体分带以 C 带和 N 带技 术为主。可以预期，随着分带技术的发展、G 带技术和其它更有效的分带技 术一定也会在植物染色体研究中得到应用和发展。
二、实验目的 通过实验，初步掌握植物染色体 C 带分带技术。
三、实验材料 蚕豆种子（当年新种子），大麦种子（当年新种子），小麦种子（当年新 种子），洋葱鳞茎（新鲜材料）。（以上材料任取一种即可）。 四、实验器具和药品1.用具：冰瓶（内装干冰）或者一只装有 CO2 压缩气体的钢瓶，温箱，恒温水浴，分析天平，小台称，量筒，烧杯，染色缸，滴瓶，载玻片，盖玻片， 剪刀，镊子，刀片，铅笔，解剖针，橡皮滴头，滤纸，牙签，玻璃板，载片 架，切片盒。　2.药品 Giemsa 母液，磷酸缓冲液，2×SSC 溶液，盐酸，甲醇，冰醋酸， 氢氧化钡，纤维素酶，果胶酶，胰蛋白酶，秋水仙素。1.Giemsa 母液Giemsa 粉剂 0.5 克 甘油（ A.R.） 33 毫升 甲醇（ A.R.） 33 毫升将 Giemsa 粉末先加入少量甘油，在玛瑙研钵内研磨至无颗粒为止，再将剩下 的甘油全部加入。于 56℃温箱内保温 2 小时，再加入甲醇，保存于棕色瓶中， 置于冰箱内。2.当量盐酸用酸滴定管量取浓盐酸配成所需当量浓度的盐酸。
比重 1.19
比重 1.16
0.1mol/LHC
8.25 毫升
9.83 加水至 1000 毫升
0.2mol/LHCl
16.5 毫升
19.66 毫升加水至 1000 毫升
1mol/LHCl
82.5 毫升
98.3 毫升加水至 1000 毫升
3.2×SSC 溶液（0.3mol/LNaCl+0.03mol/L 柠檬酸钠）称取 NaCl17.53 克和柠檬酸钠 8.8233 克置于容量瓶中加水至 1000 毫升。4.磷酸缓冲溶液A 液：配制 0.067mol/L 磷酸二氢钾称取磷酸二氢钾 9.118 克置于容量瓶加蒸馏水至 1000 毫升。B 液：配制 0.067mol/L 磷酸氢二钠　称取磷酸氢二钠 9.467 克置于容量瓶加蒸馏水至 1000 毫升。使用时按下 列比例混合成缓冲液：　pH 值：
溶液 A （毫升）
+
溶液 B （毫升）
6.7
57.0
43.0
6.8
51.0
49.0
6.9
44.8
55.2
7.0
38.8
61.2
7.1
33.0
67.0
7.2
27.6
72.5
7.3
22.3
77.7
五、实验说明　植物染色体用 Giemsa 染料染色所产生的带型属于 C 带，而不象动物染色 体那样产生 G 带，要植物染色体产生 G 带，需要不同的染料和不同的处理方 法。本实验着重介绍 Giemsa-C 带法。1.关于植物 Giemsa-C 带的说明：所谓植物 C 带主要包括四种带型。　（1）着丝粒带（centromericband），是指着丝粒及其附近的带，大部分 植物均有这种带型。上述的材料中，仅洋葱带型较浅。（2）中间带（intercalaryband），分布于染色体着丝粒至末端之间的带叫做中间带。小麦 B 组染色体中间带较多且明显；蚕豆染色体中间带一般在 长臂上。（3）末端带（telomericband），位于染色体的末端的带。洋葱有较明显的末端带，小麦仅部分染色体显示，大麦、蚕豆则不显示。　（4）核仁缢痕带（nucleolaronstrictionband），是指核仁染色体特殊 的带型、位于核仁组织中心区，蚕豆、玉米、大麦、小麦均有明显的核仁缢 痕带。由于植物染色体 Giemsa-C 带尚无统一的标准。南开大学遗传教研室在他们编写资料中，提出用带头的字母为代表，记录植物 C 带的显带情况，这是 目前较好的 C 带分类方法，现在介绍如下：①完全带类型：处理染色后，同时出现四各带有类型称为完全带，用字母CITN 表示，黑麦染色体 C 带属于这一类型。②不完全带类型：只显示三种以下的带类型，具体可再分为 4 种。a.CIN 型：缺乏末端带类型，如大麦、小麦和蚕豆的染色体。b.CTN 型：不具有中间带类型，如洋葱。c.TN 型：只有末端带和缢痕带，如玉米等。d.N 型，只有缢痕带。　除了 C（着丝粒）带之外，凡双臂染色体的，T、I、N 带均有分布在哪一 臂上的问题。如带在短臂上，把“+”号写在字母右上角；如带在长臂上，把 “+”号写在字母的右下角。还有，如若干条染色体具有同类带型，则在字母 符号前放一系数；而不显带的染色体仅用数字表示（见图 30-1）。■据此，n 种植物带型表示如下：　蚕豆 2n=12=CIN 型=2Cl++8CI++2CIN（见图 30-2） 就是说，有一对同源染色体具着丝粒带和短臂上中间带。4 对同源染色体 具着丝粒带和长臂上中间带，和一对同源染色体具着丝粒带，两臂的中间带　和缢痕带。同理，黑麦 2n=14=CITN 型　　　　　　=2CT+4CI+T+6CI+T+2CI+TN 玉米 2n=20=TN 型=6T++2T++2N++10这里的 10 表示 5 对同源染色体不显带。■　2.几种植物染色体 Giemsa-C 带显色法。 由于不同的显带方法能造成不同类型的带型，现将植物染色体分带中，常 用的显带法介绍如下：（1）N 带显带法：N 带法原指核仁形成区的特殊显带法，但后来发现 1mol/LNaH2PO4 的热处理，还能显示大麦、小麦的染色体 C 带。具体方法是将空气干燥后的大麦或 小麦染色体片子，放在盛有 1mol/LNaH2PO4 溶液，温度为 93℃的染色缸中， 温浴 5—8 分钟。蒸馏水冲洗后，用 5％Giemsa 溶液（pH7.2）染色半小时， 经水冲洗后，空气干燥，封片观察。　（2）BSG（Bariumhydroxide，Saline，Giemsa）法： 经空气干燥的蚕豆或其他植物细胞的染色体制片，用氢氧化钡饱和水溶液 处理
分钟 （ 20 — 25 ℃）。后用蒸馏水彻底冲洗， 2 × SSC（0.3mol/LNaCl+0.03mol/LC6H5Na3O7·2H2O）溶液 65℃温浴中保温两小时。再经蒸馏水冲洗，稍干后用 5％Giemsa 溶液染色 30 分钟左右，用水冲洗片子 上染料，空气干燥后，封片观察。（3）HSG（HyolorochloricacidSaline，Giemsa）法：　空气干燥后的洋葱或其它材料的染色体制片，放在 0.2mol/LHCl 中室温处 理约 1 小时。蒸馏水冲洗后，置 2×SSC 溶液中保温（65℃）15 分钟，再经 蒸馏水冲洗后，稍干用 10％Giemsa 溶液（pH6.8）染色 10 分钟左右，水冲洗，空气干燥后，封片观察。（4）胰酶 Giemsa（TrypsinGiemsa）法： 空气干燥后的蚕豆染色体或其它植物染色体制片，置于 0.05％胰酶溶液中（pH7.2）34℃温浴中保温 15—30 分钟。及时冲洗酶液，10％Giemsa 溶液（pH7.2）染色 15—20 分钟，水冲洗后，空气干燥，封片观察。 六、实验步骤（一）染色体标本的制备　可以采用酸处理压片法制备染色体或去壁低渗法制备染色体，后者详见实 验（二十八）。本实验介绍压片法制备染色体标本过程如下：1.材料培养材料的培养条件如表 30-1 所示。2.前处理　为了得到较多的中期分裂相的染色体，材料需要在分裂高峰期前 2—3 小 时用秋水仙素前处理。各种材料都可用剪下根浸入秋水仙碱溶液法进行处理（见表 30－2）。表 30 － 2 秋水仙碱的浓度和处理时间材
料
秋水仙碱浓度
处理时间（钟点）
蚕
豆
0.05 ％
14 点 30 分— 17 点 30 分
大
麦
0.05 ％
8 点— 11 点
小
麦
0.1 ％
10 点— 14 点
洋
葱
0.2 ％
8 点— 12 点
3.固定　甲醇—冰醋酸（3∶1）固定液固定 4—24 小时，以后换入 70％乙醇中置于 冰箱保存。　4.解离 用酸或酶解离，不仅使根尖组织软化，而且对以后染色体显带效果有关， 酸的浓度、温度、处理时间要严格控制。 各种材料，解离的条件很不同，需要不断地摸索，现提供一个参考的条件（表 30－3）。表 30-3 几种试验材料的解离试验材料
处 理 方 法
洋 葱
0.1mol/LHCl60 ℃ 5 — 8 分钟
蚕 豆
先在 45 ％冰醋酸中浸泡 2 — 3 小时（室温）然后在 55 ℃的45 ％冰醋酸保温 15 分钟
大麦、小麦
先用 0.5 ％果胶酶-0.5 ％纤维索酶处理 4 — 5 小时，然后在0.1nol/LHCl60 ℃ 5 分钟
5.压片、冻片和干片　将根尖放在载片中央，切取尖端不透明部分，滴上几滴 45％冰醋酸，用镊 子从盖片上轻轻敲打，使材料成一片很均匀的薄层。在酒精灯上微热，然后 将载片放在硬而平整的桌面上，以左手中指和拇指固定盖片的位置，勿使其 移动，再用带橡皮滴头的解剖针后端在盖有毛边纸的盖片上敲打至细胞破裂 染色体散开。擦干片子，在显微镜下挑选染色体分散而完整的片子，用干冰或 CO2 气体冻片，然后用保安刀片揭开盖片，盖片翻在载片上，在无尘条件下，空气干燥 1—2 周。　（二）显带处理 可以根据材料和实验需要，采用实验说明中的一种方法进行显带处理。根 据我们的经验。蚕豆和洋葱采用 HSG 法较好，而大麦和小麦采用 BSG 法效果 较好。　（三）带型分析 由于植物染色体带型还没有统一的国际化的标准，实验者可以根据自己的 工作方法和需要，记录分析的结果，比较不同材料间带型的区别，力求在染 色体分带水平上分析染色体类型和生物的遗传结构。一般通过如下步骤进 行：1.选择染色体数目完整，长度合适，分带清晰的材料进行显微摄影，冲洗放大后进行染色体剪贴（方法同组型分析）。2.详细记录各染色体上，各带纹的位置，宽窄着色深浅和形状等。　3.绘制染色体模式图，然后在各条染色体模式图上标出各条带纹的位置、 宽窄、深浅、形状等线条。七、实验结果　1.记录一种植物（以上四种中的一种）带型分析的结果，完成染色体剪贴 和带型分析的模式图（如图 30－2）。2.如果实验未能得到预期的结果，请分析原因。（沈大稜）实验三十一植物单倍体的诱发
一、实验原理 植物的无性繁殖和组织培养都说明，植物营养细胞是一个基本功能单位， 具有发育成完整植株的潜在全能性。随着组织培养技术的发展，已可把花药 放在离体条件下培养，使花粉粒分裂增殖，不经受精而单性发育成单倍体植 株。单倍体植株比正常二倍体植株矮小，染色体数为其亲体细胞（2n）的一 半（n）。单倍体经人工加倍或自然加倍，即为纯合的二倍体。育种工作者可 以利用这一特性，促使选育材料的性状加速稳定，缩短育种周期，现已成为 常规育种的一个辅助手段，也可应用于异花授粉作物自交系的培育。二、实验目的1.了解和掌握单倍体的培养方法及要点。2.了解单倍体在育种实践中的意义。 三、实验材料孕穗后期的水稻（Oryzasativa）穗子。四、实验器具和药品　1.用具：试管（30 毫米），试管架，量筒，棉塞，吸量管，接种针，酒精 灯，培养皿，无菌纸，剪刀，镊子，超净工作台或接种室。2.药品：培养基成分（见表 31-1），2，4-D、萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA），6-苄基氨基嘌呤，70％酒精，甲醛，高锰酸钾，漂白粉，铬酸，硝 酸，盐酸，氢氧化钠。3.培养基配制　（1）大量元素母液：按培养基 5 倍用量称取各种大量元素，用蒸馏水分 别溶解，逐个加入（把 Ca2+、SO2-4、PO3-4 错开，以免产生沉淀），再定容至1000 毫升，此液便是培养基 5 倍浓度的母液。　（2）微量元素母液：硼、锰、铜、锌、钴等微量元素，用量极少，可按 配方 10 倍的量配成母液。　（3）单独配制铁盐及各有机成分（除蔗糖外）的母液，这类药品用量很 少，久放容易变质，可分别配成 0.2—1 毫克/升的母液，并需放在冰箱内保 存。　有些药品不易溶解于水，如 2，4-D、萘乙酸、秋水仙素，可以先溶解于少 量的 95％酒精中，吲哚乙酸可加热溶解，6-苄基氨基嘌呤先溶解于少量1mol/LHCl，叶酸先溶解于少量 NH4OH 中，再分别加入蒸馏水，配成一定浓度的母液。 各种母液取出后，加入蒸馏水和蔗糖，花药培养蔗糖浓度较一般组织培养 要高些，常用 60 克/升，最后定容至 1000 毫升，加入琼脂后加热溶化，再用1mol/LHCl 或 NaOH 调节 pH 值，最后分装灭菌。关于培养基的选择（见表 31-2）。水稻以 Miller 或 N6 培养基较合适，花药诱导愈伤组织的培养基称去分化培养基，除上述各种成分外，还需加入 2，4-D（0.5—2 毫克/升）；促使愈伤组织分化为单倍体植株的分化培养基，则 需加入吲哚乙酸（0.5—2 毫克/升）或萘乙酸（0.2—0.5 毫克/升）和 6-苄 基氨基嘌呤（2 毫克/升）。
五、实验说明 花粉形成单倍体植株有两种方式：　1.花粉形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成单倍体植株，如水稻、麦类等 作物。　2.花粉不经愈伤组织，直接形成胚状体，如烟草、曼陀罗等。 花粉粒形成愈伤组织或胚状体，二者间不存在绝对的界限，主要取决于培 养基中生长素的浓度。 杂交育种是选育新品种最常用的方法，由于杂种后代的分离，要得到一个 稳定的品系，通常要经过五年以上的选择，应用花药培养，第二年能得到纯 合的二倍体。六、实验步骤　（一）花粉发育时期的镜检和消毒：严格掌握花粉发育时期，是愈伤组织 形成的重要因素。水稻采用单核中、晚期花粉培养比较好，从外形来看，剑 叶已伸出叶鞘，和下面一叶的叶枕距为 3—10 厘米（因品种和气候而异）， 然后镊取花药，加上一滴 15％铬酸、15％盐酸和 10％硝酸的混合液（2∶1∶1 体积）压片镜检，可以看到细胞核被染成橙黄色，单核中、晚期的花粉已形成液泡，细胞核被挤到花粉粒边缘。根据镜检花粉粒所在颖壳的颜色和花 药在颖壳里的位置为标准，剪去较嫩和较老的小穗把准备接种的小穗放在 10％的漂白粉的上清液里，消毒 10 分钟，再用无菌水冲洗 2—3 次。　2.接种和培养：将消毒的水稻小穗，对着光剪去花药上端的颖壳，用镊子 将花药剥在无菌纸上，再倒入装有培养基的试管内，放在 28℃下进行暗培 养，促使花粉粒分裂增殖，形成愈伤组织。3.单培体植株的诱导和染色体加倍：花药培养 20 天左右，在花药裂口处长出淡黄色的愈伤组织，等愈伤组织长到 2—4 毫米时，再转到含有萘乙酸（或 吲哚乙酸）和 6-苄基氨基嘌呤的分化培养基上，并用日光灯照明，二周后愈 伤组织分化出小植株，当植株长到 2—3 寸时即可移栽，移栽时先将根部的培 养基洗去，刚入土的幼苗需用烧杯罩住，防止因水分蒸发而死苗。 水稻花药培养形成的植株大多是单倍体，必需经过染色体加倍后才能结 果，一般采用 0.5％秋水仙素溶液浸泡根和分蘖节。有时经秋水仙素处理后 仍是单倍体，虽能形成稻穗和花器管，但不能结实，此时可以把地上部分剪 去，让它形成再生稻，以延长生育期来提高加倍频率。在花药培养过程中， 也有部分愈伤组织来自药壁或花丝断裂处，它们是由二倍体的亲体细胞分裂 而来，因此幼苗分化后，根尖染色体的检查是必不可少的。七、实验结果　1.统计花药诱导愈伤组织的频率和愈伤组织分化成单倍体植株的频率，其 中绿苗和白化苗各占多少。2.拍摄愈伤组织及单倍体植株的照片。 EMBED Word.Document.6 \sEMBED Word.Document.6 \s续表植物
花粉 时期
基本 培养基
附 加 成 分 (毫克/升)
首先试
花粉直接成苗
诱导花粉愈伤组织
愈伤组织分化苗
玉米
单中-单晚
Ms 或 N6
—
2,4-D(2), 动力精 (0.5-2.0),蔗糖 10-18%
萘乙酸(0.5-2.0),动力精(0.5-2.0), 蔗糖降到 8-12%
中国(1974)
茄子
单中
Ms(无机 盐)+H(有 机成分)
萘乙酸(0.005),动力精(1)
2,4-D(0.25-0.5),动力精
萘乙酸(0.01-0.1), 动力
精(1-2)
中国(1972)
油菜
单核-双核
Miller
—
2,4-D(2),吲哚乙酸(2),动力 精(1), 酵母汁 (1000), 椰乳 15%
基本培养基改为 Ms,加 吲哚乙酸 (0.2), 动力精 (2)
中国(1974)
甘蓝
单核　- 接近 成熟
Nitsch
—
硫胺素(0.25),吡哆素(0.25), 烟酸(1.25),甘氨酸(7.5),2,4- D(0.5-1.0),动力精(1.6)
萘乙酸(0.5),动力精(1)
日本(1970)
粟
单核
Miller
—
2,4-D(1)吲哚乙酸(1)
吲哚乙酸(2),动力精(4)
日本(1971)
杨树
单核
Ms 、 H 或 Miller 有机成分
—
2,4-D(1-2), 动力精(0-2), 蔗 糖浓度 3-6%
吲哚乙酸(0.2-1.0),动力 精或 6
苄基嘌呤(0.5-2.0),蔗糖浓度 1.5-3%
中国(1974)
上表摘自中国科学院北京植物研究所，黑龙江省农业科学院编著“植物单倍体育种”。（陈佩芬）实验三十二人工诱发多倍体植物
一、实验原理 自然界各种生物的染色体数目是相当恒定的，这是物种的重要特征。例如 玉米体细胞染色体有 20 个，配成 10 对。遗传学上把一个配子的染色体数， 称为染色体组（或称基因组）用 n 表示。如玉米染色体组内包含 10 个染色体， 它的基数 n=10。一个染色体组内每个染色体的形态和功能各不相同，但又互 相协调，共同控制生物的生长和发育、遗传和变异。 由于各种生物的来源不同，细胞核内可能具有一个或一个以上的染色体 组，凡是细胞核中含有一套完整染色体组的就叫做单倍体，也用 n 表示。具 有两套染色体组的生物体称为二倍体，以 2n 表示。细胞内多于两套染色体组 的生物体称为多倍体。例如三倍体（3n）、四倍体（4n）、六倍体（6n）等， 这类染色体数的变化是以染色体组为单位的增减，所以称作整倍体。 在整倍体中，又可按染色体组的来源，区分为同源多倍体和异源多倍体。 凡增加的染色体组来自同一物种或者是原来的染色体组加倍的结果，称为同 源多倍体。如果增加的染色体组来自不同的物种，则称为异源多倍体。 多倍体普遍存在于植物界，目前已知道被子植物中有 1/3 或更多的物种是 多倍体，如小麦属（Triticum）染色体基数是 7，属二倍体的有一粒小麦， 四倍体的有二粒小麦，六倍体的有普通小麦。除了自然界存在的多倍体物种
之外，又可采用高温、低温、X 射线照射、嫁接和切断等物理方法人工诱发 多倍体植物。在诱发多倍体方法中，以应用化学药剂更为有效。如秋水仙素、 萘嵌戊烷、异生长素、富民农等，都可诱发多倍体，其中以秋水仙素效果最 好，使用最为广泛。 秋水仙素是由百合科植物秋种番红花——秋水仙（Colchicumautumnale）的种子及器官中提炼出来的一种生物碱。化学分子式为 C
NO ? 1 H O。具22 25 6 2
2有麻醉作用，对植物种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等可产生诱变作用。它 的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不走向两极而被阻止 在分裂中期，这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。若染 色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性的组织，由多倍性组织分化产生的 性细胞，所产生的配子是多倍性的，因而也可通过有性繁殖方法把多倍体繁 殖下去。 多倍体已成功地应用于植物育种，用人工方法诱导的多倍体，可以得到一 般二倍体所没有的优良经济性状，如粒大、穗长、抗病性强等。三倍体西瓜、 三倍体甜菜、八倍体小黑麦已在生产上应用。二、实验目的1.了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其在植物育种上的意义。　2.观察多倍体植物，鉴别植物染色体数目的变化及引起植物其它器官的变 异。
三、实验材料玉米（2n=20），或大麦（2n=18）、水稻（2n=24）的种子。 人工诱发的四倍体玉米和二倍体玉米的果穗、玉米粒、花粉、叶片。 四、实验器具和药品　2.药品：0.1％和 0.025％秋水仙素溶液，1mol/LHCl 溶液，改良石碳酸品 红溶液（配方见实验二十八），碘化钾溶液。五、实验说明　本实验采用种子浸渍法。处理种子时，可先在一定浓度秋水仙素中浸种 24 小时左右，在铺有滤纸的器皿上浸渍种子，再注入 0.1％—0.025％浓度的秋 水仙素溶液，为避免蒸发宜加盖并置于暗处，放入 20℃培养箱中，保持适宜 的发芽温度，干燥种子处理的天数应比浸种多 1 天左右。一般发芽种子处理 数小时至三天，或多至十天左右。对于种皮厚发芽慢的种子，应先催芽后再 行处理。已发芽的种子宜用较低的浓度处理较短的时间，秋水仙素能阻碍根 系的发育，因而最好能在发根以前处理完毕。处理后用清水冲洗，移栽于盆 钵或田间。 染色体加倍后必须进行鉴别。同源多倍体主要是根据形态特性来判断，如 叶色、叶形及气孔和花粉粒的大小。最为可靠的方法，是待收获大粒种子后， 再将这些大粒种子萌发，制片根尖压片，然后检查细胞内的染色体数目，只 有染色体数目加倍了，才能证明植株已诱变成四倍体。六、实验步骤　（一）把玉米 2n=20（或大麦 2n=18、水稻 2n=24）种子浸在 0.1％秋水仙 素溶液 24 小时。（二）用自来水冲洗 2—3 次。　（三）将萌发种子移到盛有 0.025％秋水仙素溶液润湿了吸水纸的培养皿 里。（四）置入 20℃培养箱，培养发芽。（五）48 小时后取出幼苗。（六）用自来水缓缓冲洗幼苗。（七）把处理后的幼苗栽种在大田或盆钵内。（八）同期播种未经处理的玉米种子作为对照。（九）田间给以良好管理。鉴定多倍体植物七、实验结果　1.制作四倍体玉米、二倍体玉米根尖细胞压片，检查染色体数目（见实验 二十八）。2.观察四倍体玉米、二倍体玉米表皮细胞气孔的大小。　（1）在四倍体玉米叶的背面中部划一切口，用尖头镊子夹住切口部分， 撕下一薄层下表皮，放在载玻片的水滴里，铺平，盖上盖玻片，制成表皮装 片。（2）按上述同样方法制作一张二倍体玉米的表皮装片，作为对照。　（3）镜检比较四倍体与二倍体气孔和保卫细胞的大小，用测微尺测量记 载其大小。3.观察比较花粉粒的大小（1）从四倍体、二倍体玉米植株上分别采集花粉。（2）将采集到的花粉分别浸入 45％冰醋酸。（3）用滴管分别各取一滴花粉粒悬浮液，移到载玻片上。（4）滴上碘化钾溶液，盖上盖玻片，制成花粉粒制片。（5）镜检四倍体及二倍体玉米花粉粒大小。（6）用测微尺测定并记载其大小。4.作业（1）描绘四倍体玉米中期染色体图像。（2）将镜检观察结果列成一表，并分析记载结果。实验三十三植物有性杂交技术
一、实验原理 植物有性杂交是人工创造植物新的变异类型最常用的有效方法，也是现代 植物育种上卓有成效的育种方法之一。通过将雌雄性细胞结合的有性杂交方 式，重新组合基因，借以产生亲本各种性状的新组合，从中选择出最需要的 基因型，进而创造出对人类有利的新种。根据进行杂交亲本间亲缘关系的远 近（表 33-1，2，3），有性杂交又区分为近缘杂交及远缘杂交两大类，前者 是指同一植物种内的不同品种之间杂交，后者指在不同植物种或属、科间进 行的杂交，也包括栽培种与野生种之间的杂交。秈稻与粳稻属不同亚种，秈、 粳稻杂交，亦属远缘杂交。品种间杂交为近缘杂交，由于品种间亲缘关系较 近，具有基本相同的遗传物质基础，因此品种间杂交易获成功。通过正确选 择亲本，能在较短期间选育出具有双亲优良性状的新品种，但在品种间杂交 时，因有利经济性状的遗传潜力具有一定限度，往往存在有品种之间在某些 性状上不能相互弥补的缺点。而采用远缘杂交的方式，可以扩大栽培植物的 种质库，能把许多有益基因或基因片断组合到新种中，以使产生新的有益性 状，从而丰富了各类植物的基因型。通过远缘杂交又可获得雄性不育系，扩 大杂种优势的利用。但远缘杂交的最大缺点，表现在远缘杂交交配往往不易 成功，杂种夭亡，而且结实率很低，甚至完全不育；杂种后代出现强烈的分 离，中间类型表现不稳定，因而增加了远缘杂交的复杂性和困难，限制了远 缘杂交在育种实践上的应用。二、实验目的1.理解小麦或水稻有性杂交的原理。　2.了解小麦或水稻的花器构造，开花习性，授粉、受精等有性杂交基础知 识。3.掌握小麦或水稻有性杂交技术。
三、实验材料 普通小麦品种 3—4 个或水稻品种 3—4 个。四、实验器具和药品　1.用具：镊子，眼科手术剪刀，玻璃透明纸袋，回形针，大头针，铅笔， 小纸牌（白色，大小为 3×4 厘米），放大镜，棉花球，六磅热水瓶，500 毫 升烧杯。2.药品：95％酒精。1.小麦杂交技术五、实验说明（1）小麦的花器构造（图 33-1）：小麦为禾本科（Gramineae），小麦属（Tritcum）的自花授粉作物，复穗状花序，穗轴由许多短节片组成，节上着 生小穗。小穗基部着生两个护颖和 3 至 9 朵小花，第一、二朵花发育较好， 小麦上部的花有些往往不结实。每朵小花有内、外颖各 1 个，雄蕊 3 个，雌蕊 1 个。在子房下方靠外颖的一侧，有两个鳞片。开花时吸水膨胀，呈圆球 水滴状，使内外颖张开。雄蕊由花丝、花药两部分组成，花药两裂。花粉粒 光滑呈球形，扁圆形或卵圆形。花粉粒直径大小，因各类小麦而有差别。普 通小麦花粉粒直径为 61—65 微米，一粒小麦 37—45 微米，二粒小麦 48 微米。 花粉粒由二层细胞膜组成，外层为角质层体，内层为纤维质体，中间具有原生质体及二个细胞核。2.小麦杂交实验步骤　（1）选穗及整穗：在母本植株中，选择典型，健壮无病并刚抽出叶鞘未 开花的麦穗。将基部和上部发育不良的 2—3 个小穗除去。每侧各留 5—7 个 小穗，然后再把留下小穗上部发育不良的小花除去。　留基部两侧 1—2 朵发育良好的小花。有芒品种则把芒剪去，以免妨碍去 雄授粉工作。　（2）去雄：去雄工作从穗的一侧上部小穗开始顺序而下。一侧去雄完毕， 再进行另一侧去雄工作。 以免上部小穗的花药落在下部已去雄的小穗中。同时防止遗漏。常用的去 雄方法有下述二种：①裂颖法：去雄时，用左手中指和大拇指夹住麦穗再用 食指从小花颖壳的顶端处轻轻压下，使内外颖处稍有缝隙。然后用镊子小心 地除去三枚雄蕊的花药，注意不要把花药夹破及伤害柱头。如有花药破裂， 则应除去该小花，并用酒精杀死附在镊子上的花药。去雄后立即套上隔离纸 袋，悬以小纸牌。注明母本品种名称，去雄日期，去雄花数，作者等。裂颖 法工作较为简便，能够获得较多杂交种子。　②剪颖法：用剪刀剪去小花上部三分之一左右的颖壳，然后用镊子从剪口 处小心取出花药，套上隔离纸袋（悬牌及书写内容同裂颖法）。这种方法操 作方便，但剪去 1/3 颖壳，杂交种子的饱满度较差。（3）授粉：去雄后 1—3 天内即可授粉，授粉时间以上午九时左右较为适宜，下午 4 时以前亦可进行授粉。授粉前检查母本去雄穗的小花柱头，一般 未成熟柱头不分叉，衰老的柱头萎蔫无光，授粉适期柱头呈羽毛状分叉，而 且有闪闪发亮的特征。小麦花粉生活力的长短与温湿度关系甚大。在 42℃高 温条件下经 30 秒钟，花粉即丧失发芽力。在 10℃以下温度及 50％以上湿度 条件下保藏花粉，虽能保持正常发芽力，但其结实率不如直接授粉法为高。 以下列举几种常用的授粉方法。①花药授粉法：授粉时先选取穗中部已有花药露出颖外的父本植株，用镊子取下花粉成熟的黄色花药，放入去雄穗的小花柱头上。轻轻涂抹授粉，在 每朵小花中放入一枚花药。授粉结束后套上纸袋，并在纸牌上标名父本名称、 授粉日期。②花粉授粉法：选取正在开花的父本植株，在穗子上套一玻璃纸袋，弯下穗子并轻轻拍打采集花粉。然后用毛笔醮取花粉，按小花顺序依次进行授粉。 套袋挂牌等操作同上。　③捻穗授粉法：这一方法适用于剪颖去雄法的穗子，用长约 15 厘米，两 头均不封口的玻璃纸袋套住全穗。纸袋下端斜■，上端平■，分别用大头针 别住。授粉时把正在开花的父本穗倒插入纸袋。在母本穗子上凌空捻转数次。 让父本花粉撒落在小花柱头上。然后再用大头针封住纸袋上口。悬以纸牌， 并标明父本名称，授粉日期。本实验任选二种授粉方法进行比较结实率的高低。（4）实验结果的检验：　小麦杂交后受精迅速，在授粉后 4—5 天即可检查，凡柱头枯萎，子房膨 大者，说明已结实。25—30 天后收获杂交种，脱粒，保存。按下表填写实验 结果。并对结果进行分析比较。　授粉方式
杂交组合■
去雄花数
授粉花数
结实数
结实率％
捻穗授粉法
花药授粉法
2.水稻杂交技术　（1）水稻的花器构造：栽培稻（OryzasativaL.）属禾本科，稻属植物。 稻穗为圆锥花序，其上着生小穗。穗轴有 2 个节，由节着生枝梗。从枝梗再 生出小枝梗，其先端着生小穗。一个小穗为一颖花，由内颖、外颖、护颖、 副护颖、鳞片、雌蕊、雄蕊各部分组成（图 33-2）。 内外颖：内外颖呈尖底船状，位于两护颖之间，外颖有芒或无芒，内颖一 般无芒。 护颖与副护颖：护颖着生于内外颖的外侧，长度一般约为内外颖的三分之 一左右。副护颖着生在小穗轴的顶部。呈膨大的环状体。两边明显倾斜，形 成极小的鳞片状。鳞片：位于外颖内侧，为扁平无色的肉质薄片，共有二枚。　雄蕊：雄蕊 6 个，每 3 个一排，着生于子房基部。花丝细长。花药分为四 室、花粉粒表面较光滑呈球形。 雌蕊：分柱头、花柱和子房三部分。位于颖花的中央。柱头羽状分叉，子 房卵形。内有一个胚珠，为内外珠所包着。胚珠上方有珠孔，珠被内由薄壁 细胞组成的珠心，是胚珠的重要部份。珠心内有一个发育着的生殖细胞的胚 囊。（2）实验步骤：①选择单株：选择生长健壮、无病害，并对原品种或品系有代表性植株 2—4 株。　②选择单穗：从所选单株中选出已抽出 1/3—2/3 的单穗，将所选定去雄 之穗，剥去叶鞘，以防折断茎杆。③剪去上部和基部颖花：用剪刀将穗顶部已开过花的颖花剪去。同时剪去穗部过嫩的颖花（花药高度不到颖花的一半）。　④去雄：去雄方法有下列二种： a.温汤去雄法：水稻花粉与雌蕊耐温性不同，根据这一原理，选择一定温 度的温水处理颖花，就可达到既可杀死花粉而不影响雌蕊生活力的目的。一 般秈稻采用 43℃温水浸穗 5—10 分钟，粳稻则采用 45℃温水浸穗 5 分钟效果 较好。具体方法是把热水瓶的温水调节好，选好稻穗，把稻穗轻轻压弯，穗 子全部浸入温水之中。5 分钟后移去热水瓶，取出稻穗。剪去未开花颖花。 留下开花颖花。　b.剪颖摘除花药法：用剪刀斜剪去颖壳 1/3—1/4（防止剪得过低伤及柱 头，过高则不易摘除花药，对授粉也不利）。用镊子取出六个雄蕊，但不能 损伤雌蕊。去雄后套袋，悬以纸牌标名母本名称、去雄日期、作者姓名等。⑤授粉：a.检查母本植株穗：整穗去雄是否彻底，有否漏剪的颖花。b.父本穗的采集：开花前安排足够时间采集父本穗，选取正在开花的单穗（穗顶部的一些颖花已能看到花药）。在穗部以上适当长度处剪断，插在盛 水烧杯内备用。c.捻穗授粉法：参阅小麦杂交技术实验步骤中授粉一节。d.花药授粉法：参阅小麦杂交技术实验步骤中授粉一节。　⑥套袋挂牌：将玻璃纸袋套在稻穗上，留将纸袋基部边缘折叠，用回形针 把折叠处夹住使之固定，将杂交纸牌系在已授粉母本植株的茎杆上。（3）实验结果的检验：每人用上述二种去雄方法各做 2—4 穗，授粉后 3—4 天检查子房是否膨大，杂交后 25－30 天，杂交种子即已成熟，剪下稻穗 用手工脱粒，晒干保存，按下表统计收获种子数，并比较两种去雄方法的杂 交效果。实验三十四植物细胞的脱分化和分化培养一、实验原理 分化了的植物根、茎、叶细胞往往具有全能性，在一定条件下进行离体培 养，给于一定的营养与激素，可以脱分化为愈伤组织，由愈伤组织制备成细 胞悬浮液，在一定的条件下经振荡培养，逐渐形成具有两极性的胚状体，经 过进一步的分化培养，给于不同的营养和激素成分，又可以生出完整的小植 株。植物的脱分化和分化培养，证明分化了的植物细胞仍具备形成全整植株 所需要的全套基因。在一定条件下，活动的基因可以关闭、已关闭的基因又 可以重新启动、再行由胚到成熟植株发育过程中有关基因的先后活动程序。 二、实验目的1.通过实验，掌握无菌操作方法，将胡萝卜贮藏根培养成为愈伤组织。2.用无菌操作方法，把烟草组织或甘蓝花茎直接培养成分化小植株。 三、实验材料胡萝卜贮藏根每组二根，甘蓝花茎或烟草茎每组二根。 四、实验器具和药品　每组铝饭盒 3 个，大培养皿 2 套，250 毫升烧杯 2 只，漂白粉过滤液 200 毫升，70％酒精，酒精棉花，镊子 2 把，保安刀 2 把，小镊 1 把，无菌水。 脱分化培养基各组 6 瓶，30 毫升/瓶分化培养基各组 4 瓶，30 毫升/瓶MS 培养基：每升中含CaCl2 · 2H2O 0.44 克KNO2 1.9 克NH4NO3 1.65 克KH2PO4 0.15 克MgSO4 · 7H2O 0.37 克MnSO4 · 4H2O 22.3 毫克ZnSO4 · 7H2O 11.5 毫克H2BO3 6.2 毫克KI 0.83 毫克 CuSO4 · 5H2O
0.025 毫克 Na2MoO4 · 2H2O
0.25 毫克 CoCl2 · 6H2O
0.025 毫克 FeSO4 · 7H2O
27.8 毫克 Na2EDTA
37.3 毫克 Nicotinieacid （烟酸） 0.5 毫克 ThiamineHCl （ B1 ）
0.1 毫克 PyridoxineHCl （ B6 ）
0.1 毫克 甘氨酸
3.0 毫克 肌-肌醇
100.0 毫克蔗糖 20.0 克固体培养基：MS 液体加 0.8％琼脂脱分化培养：MS 培养基加 2，4－D2 毫克/升 BA0.2 毫克/升分化培养基：1.MS 培养基加 KT（或 BA）2 毫克/升2.MS 培养基加 KT（或 BA）2 毫克/升+IAA0.05 毫克/升　其中 KT 为激动素、BA 为 6-苄基嘌呤、IAA 为吲哚乙酸（2 种分化培养基， 采用一种即可）
五、实验说明 脱分化培养基和分化培养基的主要区别在于激素的成分和含量上，说明各 种激素的出现和含量改变对于植物组织分化起着重要的作用。许多植物从脱 分化到分化过程对培养基里激素成份要求严格、有的还要进行液体培养才能 重新分化。例如，胡萝卜贮藏根组织，是最早用于研究植物细胞的全能性的 材料，至今仍是研究脱分化的好材料，但当胡萝卜组织形成愈伤组织之后， 若要它们重新分化，必须经过振荡培养和采用合适的培养基，条件较为复杂。 另一些植物，例如烟草的根、茎、叶和甘蓝的花茎等容易进行脱分化和分化 培养，不需液体振荡培养可以在固体培养基上直接完成，是两类较好的实验 材料。六、实验步骤（一）操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，尽量做到不带菌。　（二）将事先用自来水洗净的烟草茎，甘蓝花茎或胡萝卜贮藏根切成一定 的大小（一般茎、根约为 2 厘米长、宽）。（三）完成以上步骤后，又应用 70％酒精棉花擦手，以便再行消毒。（四）用消毒镊子将根或茎的切段投放到装有 70％酒精的大培养皿中浸泡30 秒钟。　（五）切段自酒精中取出后，立即浸泡于装有 15％漂白粉精片水溶液的大 培养皿中达 20 秒钟。（六）以上组织切段经分别装有无菌水Ⅰ、Ⅱ的铝饭盒各 10 分钟，进行漂洗，最后置于无菌水Ⅲ中达 20 分钟以上。　（七）切段自无菌水中取出后，立即放于 9 厘米灭菌培养皿中，盖上皿盖， 放于灭菌接种箱。（八）在灭菌箱中，无菌操作，削去植物茎、根的外部，叶子的边缘。（九）把正常部分切成 3mm×3mm×1.5mm 大小方块，叶组织切成 1.5cm×1.5cm 方块。　（十）由小镊子和接种针，在无菌条件下，将组织小块放入盛有脱分化培 养基的三角烧瓶中，每瓶放 5—6 茎，根组织块或 3—4 块叶片组织块。挂上 标签，写明日期，组号。（十一）20℃—25℃避光培养 3—4 星期后观察。　（十一）烟草或甘蓝的花茎、长成的愈伤组织，可用同样的无菌操作法， 再接种到分化培养基上，3—4 星期再进行观察。 胡萝卜材料要经过液体培养基振荡培养，才能分化（本实验从略）。七、实验结果（一）观察并记录接种的脱分化培养的组织细胞有无污染？（二）愈伤组织细胞是否出现绿色？讨论其来源与影响？　（三）烟草组织或甘蓝花茎经过分化培养、长出完整的植株，说明什么问 题？在理论和实践中有何价值？　实验三十五诱变物质的微核测试
一、实验原理 微核（micronuclei）简称（MCN）是真核类生物细胞中的一种异常结构， 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或 椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核 1/3 以下。微核的折光率及细胞化 学反应性质和主核一样，也具合成 DNA 的能力。一般认为微核是由有丝分裂 后期丧失着丝粒的断片产生的。我们科研工作证实，整条的染色体或好几条 也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便 形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应 呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的间 期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合 成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏， 技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推 测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种 比较理想的方法。目前国内外不少部门已把“微核测试用于辐射损伤、辐射 防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。 现有的微核测试系统多数是用哺乳动物的骨髓细胞或外周血细胞。缺点是 需要一定培养条件与时间、细胞同步化困难、微核率低，一般只在 0.2％左 右。近年来，有人采用高等植物花粉孢子利用它们天然的同步性作微核测试 材料，取得良好的效果。其 中马德修用一种原产于美洲的鸭跖草 （Tradescantiapaludosa）（一种叶子狭长形的鸭跖草，目前我国许多地方已经引种），建立四分孢子期微核率计数（MCN-in-Tetrad）的测试系统，是 近年来报导的较好系统之一。该系统用低剂量的化学药物处理或辐射处理， 其微核率可达 10％—67％。二、实验目的1.是了解微核测定的方法与意义。2.为寻找新的测试系统或测定更多的环境因素。 三、实验材料具有幼嫩花序的鸭跖草（长在温室中的鸭跖草都能现蕾开花，大田栽培花期也很长），剪取花序，每种处理重复 3 根。 四、实验器具和药品1.培养液：Knop 氏培养液：1000ml 蒸馏水+磷酸二氢钾 0.25g+硫酸镁0.25g+硝酸钙 1.00g+硝酸钾 0.25g+微量磷酸铁。2.处理液：EMS（甲基磺酸乙酯），由培养液配成，50mmol/L，75mmol/L，100mmol/L，150mmol/L 等各种处理浓度。NaN3（叠氮钠），由培养液配成，0.2mmol/L0.4mmol/L，0.8mmol/L 等各种浓度。 DES（硫酸二乙酯）由培养液配成 50mmol/L，100mmol/L，150mmol/L 等各 种浓度。3.固定液：3 甲醇：1 冰醋酸 染色：改良碱性品红液（配法参看实验二十八）实验用具：30ml 三角烧瓶，剪刀，镊子，载玻片，盖玻片等。 五、实验说明　处在分裂过程中的细胞，对理化因素的处理是有一定敏感时期的。鸭跖草 的花粉母细胞在减数分裂前期对药物作用较为敏感，所以要取幼嫩的花序进　行试验。各个花序中间老、两边嫩，一般能找到具适合时期的花芽。前期造 成的染色体损伤应经过 24—30 小时的培养，在四分体中以微核形式出现。处 理过程中所产的落后染色体或落后染色体组也能在四分体中以较大形式的微 核出现。大、小微核形成机制有所不同，此处均作染色体变化指标。六、实验步骤　（一）各三角烧瓶中加入各种浓度的处理药物和 Knop 培养液。各种处理 重复 3 瓶、并留 3 瓶 Knop 液作对照。Knop 液含 0.2mmol/LNaN3 （叠氮钠） 3 瓶Knop 液含 0.4mmol/LNaN3 3 瓶Knop 液含 0.8mmol/LNaN3 3 瓶Knop 液含 50mmol/LEMS （甲基磺酸乙酯） 3 瓶 Knop 液含 100mmol/LEMS 3 瓶 Knop 液含 150mmol/LEMS 3 瓶 Knop 液含 50mmol/LDES （硫酸二乙酯）
3 瓶 Knop 液含 100mmol/LDES 3 瓶 Knop 液含 150mmol/LDES 3 瓶 对照 Knop 液
3 瓶（二）剪取新鲜的鸭跖草花序，每瓶插入 3 根，24℃中光照培养 30 小时。　（三）培养的花序分瓶固定在 3 甲醇：1 冰醋酸固定液中，48 小时后转移 到 70％酒精中，可长期冰箱保存。（四）取适当大小，处于四分孢子早期的材料，改良碱性品红染色压片观察（见实验二十八）。
七、实验结果 微核数/四分孢子数，填表并作曲线图。测定微核结果：A.甲基磺酸乙酯（ EMS ）处理 MCN/Tetrad100重复
对照
50 m molL
100m m olL
200 m molL
123
B.叠氮钠（ NaN3 ）处理 MCN/Tetrad100重复123
对照
0.2 m molL
0.4 m molL
0.8 m molL
平均
C.硫酸二乙酯（ DES ）处理 MCN/Tetrad重复
D.其它处理■实验三十六植物同工酶技术
一、实验原理 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形 式，即催化同一种反应而结构不同的一族酶。它们是受遗传体系决定的酶的 不同分子形式。利用凝胶电泳技术可以将它们分开，用专一的作用底物和特 殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上呈现同工酶谱。二、实验目的　1.通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分析在遗传学研究 中的意义。2.着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方法。 三、实验材料以下内容任选一组或二组即可1.二种不同品种蚕豆。2.蚕豆的新种子和储藏 2—3 年陈种子。3.蚕豆与豌豆。4.甘蓝和甘蓝型油菜的幼苗嫩叶。5.不同品种的柑桔嫩叶。四、实验器具和药品1.用具：电泳仪，电泳槽，注射筒及针头，微量注射器，装凝胶用玻璃管（内径为 5 毫米、长度为 90 毫米）、离心机。　2.药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris），四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰 胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺（Bir），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝， 联苯胺，过氧化氢。五、实验说明　同工酶的不同分子形式，可以出现在同一生物的不同发育时期，所以取不 同期的材料，酶带的情况就不一样。这是同工酶技术适用于发育研究的方便 之处。另一方面，利用同工酶技术进行遗传学分析与群体遗传学研究时，则 特别要求取材的一致性。否则，它们之间的差异可能不是遗传而是由发育造 成的。例如要比较两个品种蚕豆的遗传差别，可用它们的发芽种子进行比较。 但这时至少应该检查是否是同年的种子、是否在发芽前都晒过种、是否是同 时浸种，是合是恒温发芽，以及是否是取同样部位和同样分量等。六、实验步骤　（一）不同品种或种间的植物，取发育时期相同，组织相同的样品，制备 酶粗提液。一般取样 0.5 克，或在恒温条件下发芽的幼苗 3—5 个，置于研钵 中，加入 0.1 毫升—0.5 毫升水研磨匀浆、后将样品移至小离心管中离心（3500rpm）15 分钟，取上清液，混入等体积的 50％的蔗糖溶液，电泳前可 在冰箱中保存。（二）聚丙烯酰胺凝胶系统的配制A 液：1mol/LHCl48.0 毫升，Tris36.4 克：TEMED0.23 毫升加水至 100 毫升，pH8.3。B 液：丙烯酰胺 28.0 克；甲叉双丙烯酰胺 0.735 克加水至 100 毫升。C 液：过硫酸铵（用前配制）1.4％。 配胶：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.4∶4.6配胶后立即灌好装胶的玻璃管（三）电极缓冲液配制 Tris30.0 克甘氨酸 14.4 克加水至 1000 毫升、pH8.3、使用时稀释 10 倍。（四）染色液配制——过氧化物酶染液 醋酸联苯胺溶液 5 毫升，3％H2O22 毫升，H2O93 毫升（五）加样和电泳各根凝胶管加入 0.05 毫升的样品酶粗提液 0.05 毫升。加一小微滴 0.005％溴酚蓝，上下电泳槽加电极缓冲液后在低于 15℃气温中，每管电流 2mA 进 行电泳，当溴酚蓝迁至凝胶下端 0.5—1 厘米时停上电泳。电泳时间 3—4 小 时。　（六）用长针头注射器注水法自凝胶管中取出凝胶，凝胶要完整，不能断 裂。　（七）染色：将完整的凝胶条置于中号试管中，加入染色液，浸泡整条凝 胶，室温下染色 20—30 分钟，呈现酶带后取出凝胶，用水漂洗终止染色。（八）带型清楚的胶应作摄影记录或作扫描测定，胶凉干后还作永久保存（图 36－1）。七、实验结果1.记录实验的操作程序，检查是否和原设计相符合？2.将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和移动距离填入表中。）3.选择比较组分胶柱中、着色最深的酶带或特殊酶带（即该组分特有酶带），计算酶带的相对迁移率 Rf 值某酶带迁移距离Rf
? 溴酚蓝指示剂迁移距离
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