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[求助]求助流式细胞仪测定细胞ROS的方法？
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[求助]求助流式细胞仪测定细胞ROS的方法？
我用流式细胞仪测定SY5Y细胞的ROS？请问有谁做过吗？能告诉我具体方法和注意事项吗？不甚感激！
所加入的荧光探针DCFH-DA，如何配置，需要储存浓度和工作浓度各是多少？
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请教：DCFH-DA需要现配吗？
活性氧应该在外界因素作用后多长时间检测比较合适！既然活性氧化学性质活泼，是不是检测晚了，结果会偏低？
请各位师兄师姐帮帮忙，多谢！
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给药前或造模前半小时加入荧光探针
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到GOOGLE上收DCFH-DA，你可以进入碧云天的网站，他们有详细的说明书，照着做就行了
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我用的是碧云天的试剂盒,探针也是DCFH-DA,浓度和阳性对照是按说明书加的,效果不错.一般是探针孵育20mins到３０mins，然后加阳性对照和自己感兴趣的药物刺激细胞，上机检测．
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请问：有流式上机检测之前，细胞是要消化成悬浮液吗？还是直接就可以在6孔板上检测吗？谢谢
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介绍一下我的方法：
1.DCFH-DA配制
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无 荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
DCFH-DA分子量：487.29 g/mol，我买的是sigma的，很便宜。文献使用的终浓度为5－50uM，一般用10uM，我使用的是20uM，建议正式做实验前先摸个DCFH-DA的合适浓度。用DMSO配成20mM母液，－20度冻存。
加药处理完（我从收细胞到检测需要操作3小时）
1，消化收集细胞，注意连上清一起收集，收集所有的细胞，放入EP管。
2，温PBS洗一遍。
3，用无血清培养液按1000:1配DCFH-DA，每个样本需要1ml工作液，预温。
4，每个样本用1ml工作液重悬
5，将EP管放入培养箱，孵育20min－1h，我孵育30min。每隔3-5分钟颠倒混匀一下。
6，离心收细胞，温PBS洗3遍，注意弃尽上清，因为DCFH-DA本底很高。
7，1ml PBS重悬，上机检测，使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用。
1，收集细胞要完全，连同培养液上清一起离心，这是收集细胞的常规操作。
2，预温的试剂室温其实就可以了，不要用冰的，这样会影响DCFH的反应。
3，对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先用DCFH-DA处理，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后用DCFH-DA处理。我处理时间是24h，所以先处理，后用DCFH-DA。
4，由于我的药物会使细胞漂起来，所以采用消化收集细胞的方法，收集所有细胞，但洗细胞的时候很麻烦。如果细胞贴壁很好，就不要这么麻烦了。直接在平皿里洗洗，DCFH-DA处理，再洗洗，再消化收集细胞，上机检测。操作很简单。
5，实验过程不需要避光。
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其实并非一定要用流式来测，DCF是一种绿色荧光，所以只要是能测荧光的方法就可以测。要求不高的话，或只是要定性检测的话，在荧光显微镜下看看就可以了。另外，还可以用荧光读板机来测，也是很好的，不一定非要用流式。
用荧光读板机的话，就可以用专用的96孔板来养细胞，并检测，操作简单，不需要像流式检测那样来收细胞，但结果不如流式精确，因为：1，荧光读板机读值的时候，是取某些点的荧光值，并不是整个底面的荧光值，所以不能准确反应所有细胞的荧光强度；2，每孔的细胞数目有限，所以荧光值不可能太高，有时甚至很低，从而本底的影响就会比较大；3，孔于孔之间如果细胞数有差异，那么也会影响结果，由于流式检测的细胞数目是一定的，所以不存在这个问题。要解决这个问题就需要采用内参矫正。方法有用hochest 33342染色，激发波长为352 nm，发射波长为461 nm，由此测得的值为内参，反应细胞数目，DCF荧光值/ hochest 33342荧光值即为矫正后的实际荧光值。不过据说用hochest 33342来做很贵。我用的是一种很便宜的方法，就是MTT。测完DCF后，加入MTT，再到酶标仪上测个OD，也是内参，简单、方便、便宜。
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为了解决上述荧光读板机存在的局限，我把流式和上面的方法结合起来。
首先，种板加药处理细胞和流式是一样，这样细胞数很多，DCFH-DA处理过程也和流式一样，只是不上流式检测。
取一半细胞，用专用裂解液裂解，我用的这个裂解液是做transwell时，chemicon ECM 554试剂盒里带的，当时没用，现在就用来做这个。配方大家可以去网上查查。取荧光读板机专用的96孔板，先放进机子测一个本底。再拿出来，每空滴上细胞裂解液，检测。这样做的好处是，1，如果直接在孔里种细胞，细胞量比较少，最多2－3×104，而用裂解的方法，细胞量可以增加几十甚至几百倍，本底的影响就很小了。2，裂解液的荧光是很均匀的，从而避免直接种板细胞分布差异带来的影响。
另一半细胞用培养液重悬，加MTT，12000 rpm，5min，离心收集紫色结晶，加DMSO溶解，加入普通96孔板，酶标仪检测。
至于每孔加多少裂解液，或每孔加多少溶解结晶后的DMSO，关系不大，因为最后所得的都是相对值，但不要太少，太少读数太小，也不要太大，超过机器读数的线性范围。
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这么做比流式麻烦，但如果用别人的流式要给钱，那就不妨试试这种方法，呵呵细胞ROS测定试剂盒说明书1_百度文库
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细胞ROS测定试剂盒说明书1
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&&&&软路由ROS 普通QOS策略 HTB+PCQ 脚本 通过测试100﹪好用
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欢迎提出宝贵意见！共同进步。
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