橙色红曲菌桔霉素合成相关基因-orf3和ctnE缺失菌株的构建及其相关分析--《南昌大学》2012年硕士论文
橙色红曲菌桔霉素合成相关基因-orf3和ctnE缺失菌株的构建及其相关分析
【摘要】：红曲菌(Monascus)是我国重要的微生物资源,能产生多种生物活性物质,是目前世界上能够生产食用色素的重要微生物之一。但是红曲菌同时也会产生一种有毒物质—桔霉素,阻碍了红曲产品的应用。
本文采用基因敲除技术,构建了orf3基因和ctnE基因缺失菌株,分析了其次级代谢产物生产情况,为阐明桔霉素的代谢途径奠定了基础。研究内容及结果如下：
1、应用NCBI Blast系统分析orf3基因和ctnE基因,推测出orf3基因编码的蛋白为DIOX-N超级家族,ctnE基因编码的蛋白为NADB-Rossmann超级家族。
2、采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化技术将置换型打靶载体pORF3-HPH和pCTNE-HPH分别转入橙色红曲菌AS3.4384原生质体中,分别采用潮霉素抗性筛选、PCR验证、打点杂交验证和Southern杂交验证转化子,最终获得2株orf3基因缺失菌株和1株ctnE基因缺失菌株。
3、采用HPLC法检测orf3和ctnE基因缺失菌株发酵产物中桔霉素含量；采用紫外分光光度计法检测红曲色素含量。最终发现,2株orf3基因缺失菌株的桔霉素产量与出发株相比,分别降低了87%和86%,红曲色素产量则分别升高了13%和15%,说明orf3基因与桔霉素的生物合成相关,但是该基因的缺失不影响红曲色素的合成；ctnE基因缺失菌株的桔霉素产量较出发株降低了96%,红曲色素产量提高了40%,由此可知,ctnE基因与桔霉素的合成有关,而且该基因的缺失有利于红曲色素的合成。
【关键词】：
【学位授予单位】：南昌大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q93【目录】：
摘要3-4Abstract4-5缩略语5-6目录6-8第1章 综述8-21 1.1 前言8 1.2 桔霉素8-14
1.2.1 桔霉素8-9
1.2.2 桔霉素生物合成研究9-11
1.2.3 桔霉素合成相关基因11-12
1.2.4 桔霉素的检测12-13
1.2.5 桔霉素含量的控制13-14 1.3 基因敲除技术14-19
1.3.1 基因敲除的概念14-15
1.3.2 基因敲除的常用技术15-16
1.3.3 丝状真菌基因敲除的技术路线与方法16-18
1.3.4 基因敲除在丝状真菌研究中的应用18-19 1.4 研究目的和意义19-21第2章 orf3基因缺失株的构建及其功能分析21-48 2.1 实验材料21-23
2.1.1 菌株和质粒21
2.1.2 酶和试剂21
2.1.3 缓冲溶液21-22
2.1.4 培养基22-23
2.1.5 主要仪器与设备23 2.2 实验方法23-32
2.2.1 orf3基因生物信息学分析23-24
2.2.2 打靶载体24
2.2.3 引物序列24-25
2.2.4 红曲菌的培养25
2.2.5 红曲菌原生质体的制备与转化25-26
2.2.6 红曲菌转化子的培养26
2.2.7 红曲菌基因组DNA的小量提取(玻璃珠法)26
2.2.8 红曲菌基因组DNA的大量提取(简便法)26-27
2.2.9 目的缺失菌株的验证27-31
2.2.10 orf3基因缺失菌株桔霉素和色素分析31-32 2.3 实验结果32-42
2.3.1 orf3基因的生物信息学分析结果32-33
2.3.2 打靶载体pORF3-HPH的转化33
2.3.3 目的缺失菌株的验证33-36
2.3.4 orf3基因缺失株桔霉素和色素分析36-42 2.4 讨论42-47
2.4.1 打靶载体的选择42
2.4.2 原生质体的制备42-44
2.4.3 原生质体的转化与再生44
2.4.4 转化子基因组DNA的提取44-45
2.4.5 orf3基因功能分析45-47 2.5 小结47-48第3章 ctnE基因缺失株的构建及其功能分析48-63 3.1 红曲菌与质粒48 3.2 实验方法48-52
3.2.1 ctnE基因生物信息学分析48
3.2.2 打靶载体48-49
3.2.3 引物序列49
3.2.4 红曲菌的培养49
3.2.5 红曲菌原生质体的制备与转化49
3.2.6 红曲菌转化子的培养49
3.2.7 红曲菌基因组DNA的小量提取49
3.2.8 红曲菌基因组DNA的大量提取49
3.2.9 目的缺失菌株的验证49-52
3.2.10 ctnE基因缺失株棺霉素和色素分析52 3.3 实验结果52-60
3.3.1 ctnE基因的生物信息学分析结果52-53
3.3.2 打靶载体pCTNE-HPH的转化53
3.3.3 目的缺失菌株的验证53-56
3.3.4 ctnE基因缺失株桔霉素和色素分析56-60 3.4 讨论60-62
3.4.1 打靶载体的选择60-61
3.4.2 ctnE基因功能分析61-62 3.5 小结62-63第4章 结论与展望63-64 4.1 主要研究结论63 4.2 进一步工作的方向63-64参考文献64-69致谢69-70个人简介70
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京公网安备75号伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备--《江苏大学学报(医学版)》2007年02期
伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备
【摘要】：目的:为深入研究伤寒沙门菌调节因子phoP的功能,制备伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株。方法:根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在5′末端加接酶BglII位点,PCR扩增phoP基因上、下游片段后,用BglII消化,再定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后并导入自杀质粒pG-MB151的BamHI位点,将阳性质粒用电转化导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的phoP基因缺失297个碱基。结论:成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R378【正文快照】：
在原核生物细胞膜上有许多特殊的感受分子(sensor)可与胞内的效应调节分子(response regula-tor)相偶联,构成双组分调节系统(two-componentregulatory system),参与原核生物细胞内信号转导。感受分子多为ATP依赖性蛋白激酶,在外环境的作用下,胞内侧近C末端区域的组氨基酸残基
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京公网安备75号非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究--《病毒学报》2001年01期
非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究
【摘要】：将反向串联的痘苗病毒启动子 p11k和 p7.5k表达结构引入非复制痘苗病毒质粒载体 ,得到非复制痘苗病毒表达载体 pNEOCK11β75、pNEOCK75 11β、pNEOCK1175和 pNEOCK75 11。利用载体 pNEOCK11β75、pNEOCK75 11β及 pNEOCK11β75IL6和RVJ12 3重组病毒进行同源重组 ,分别得到非复制重组痘苗病毒RVJ12 3Δ11β75、RVJ12 3Δ75 11β及RVJ12 3Δ11β75IL6。Southern blot证实 :重组病毒RVJ12 3Δ11β75C K片段间大片段基因的稳定缺失 ,同时 β 半乳糖苷酶基因插入到缺失
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R373.1+2;;Q786【正文快照】：
近年来 ,以痘苗病毒为载体的重组疫苗研究取得了重要进展 ,到目前为止 ,已有包括麻疹、ＥＢＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＨＩＶ及狂犬病毒等 10余种重组痘苗病毒疫苗株进行了初步的人体免疫观察[1] 。这些进展表明痘苗病毒载体在重组疫苗的研究中具有广泛的应用前景。然而痘
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副猪嗜血杆菌ompP2和ompP5缺失株生物学特性及比较蛋白组学的研究
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定的条件下侵入机体而引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征革拉泽氏病(Glaisser’s Disease)。该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。由于遗传操作工具的缺乏，对其毒力相关因子和致病机理知之甚少。外膜蛋白(OMPs)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，具有维持外膜结构，保证物质运输，参与细菌的致病过程等一系列的功能。OmpP2和OmpP5是H.parasuis OMPs中两个主要的成分，可能参与细菌的致病过程。本研究旨在以本地分离血清4型强毒株SC096为亲本株，利用遗传操作技术分别构建了△ompP2和△ompP5缺失株，对其进行生物学特性的研究。最后利用比较蛋白质组学方法，进一步阐明蛋白功能和在H.parasuis致病过程中的作用和分子机制。具体工作如下：　　1.H.parasuis遗传操作系统的建立及构建△ompP2和△ompP5缺失株　　利用接合转移和电击转化无法获得△ompP2和△ompP5缺失株。根据已报道自然转化方法，也无法获得基因突变株。从全基因组序列中发现ACCGCTTGT序列与已报道的USS很相似。为了证实该序列适用H.parasuis自然转化，构建了质粒pZB5。用7个分离株和4个参考菌株进行自然转化，结果只有血清4型分离株SC096能发生自然转化。为了获得更高的转化效率，从质粒与亲本株孵化时间，质粒浓度和cAMP浓度进行条件优化。在孵化5 h时转化频率最高，为4.3×10-4转化子/CFU；当质粒的浓度为0.2μg达到饱和，且转化频率最高，为3.89×10-4转化子/CFU；在无cAMP和不同浓度条件下，获得的转化子无显著差别。以上结果表明成功建立了一种改进的自然转化方法并对其进行优化，为H.parasuis的遗传操作和基因功能的研究提供了技术平台。　　利用已建立的自然转化方法，构建了质粒pZB6和pZB7，分别转化SC096菌株后，获得△ompP2和△ompP5缺失株。构建了ompP2基因单拷贝基于染色体的互补质粒pZB8，将pZB8转化到△ompP2缺失株后，获得其互补菌株。通过PCR检测和基因测序进行鉴定，结果证实构建成功。　　2.H.parasuis SC096株△ompP2和△ompP5缺失株生物学特性研究　　分别提取菌株OMPs后，SDS-PAGE电泳后发现△ompP2缺失株OMPs在37kDa处出缺失了一个主要的蛋白条带，其互补株恢复这一特性。在△ompP5缺失株中，发现在33kDa处缺失了一个主要的蛋白条带。通过生长特性的测定，发现缺失株的生长速度明显变慢，互补株恢复生长能力。说明了OmpP2和OmpP5调节了SC096菌株的生长，缺失后导致生长缓慢。通过对9种氟喹诺酮类，β-内酰胺类抗菌药物和4种有机溶剂的最小抑菌浓度(MIC)的测定来对菌株的耐药性和敏感性进行研究，结果发现△ompP2缺失株对左氧沙星、头孢克洛和苯唑西林的MICs值显著增加，对Tween-20和Triton X-100的MICs值显著降低，互补株除了苯唑西林以外都恢复正常，而△ompP5缺失株无显著的变化。说明了缺失ompP2基因后，可能影响了细胞膜的通透性，从而导致了对抗菌药物耐药性和有机溶剂敏感性的增加。在细菌形态上，△ompP2缺失株形态结构发生改变，有的细菌长度明显的增长。另外缺失株荚膜的厚度明显变薄或消失，互补株恢复正常，而△ompP5缺失株无显著的变化。说明了OmpP2影响和调节了细菌的形态结构和荚膜的合成。　　在抵抗血清中补体杀菌作用方面，SC096株具有很高的抵抗血清杀菌的能力。但是对OmpP2的缺失显著地降低了菌株对猪血清和兔血清的抵抗能力，互补株恢复抗血清的能力，而△ompP5缺失株无显著的变化。说明了OmpP2参与了抵抗血清中补体杀菌作用。以猪肾上皮细胞(PK-15)和猪脐静脉血管内皮细胞(PUVEC)为模型，研究缺失株对宿主细胞黏附入侵能力的变化。与SC096株相比，△ompP2缺失株对PK-15和PUVEC的黏附能力升高了4-5倍，而入侵能力升高了7-8倍。而互补株的黏附入侵的能力相对于缺失株显著地下降，但没有恢复到wild-type SC096株的水平。而△ompP5缺失株无显著的变化。以上结果说明了缺失ompP2基因后，导致菌株对细胞的黏附入侵的能力显著增加。　　以BALB/c小鼠为模型比较毒力，结果显示△ompP2缺失株的LD50(1.41×109 cfu)是SC096株LD50(8.90×108cfu)的1.5倍，而互补株的毒力恢复正常(8.72×108cfu)。而△ompP5缺失株(7.90×108cfu)无显著的变化。对小鼠致病性的下降可能是△ompP2缺失株激活了宿主体内的补体系统所导致。将菌株灭活后制备成油苗免疫小鼠，间隔两周二免后。用SC096株5LD50进行攻毒，结果SC096、△ompP2缺失株，互补菌株和△ompP5缺失株免疫组都能产生100％的保护。说明了△ompP2和△ompP5缺失株诱导免疫保护的能力没有下降。　　3.Wild-type SC096和△ompP2缺失株比较蛋白组学的研究　　鉴于△ompP2缺失株具有显著的生物学特性的变化，本研究应用双向电泳(2-DE)技术结合MALDI-TOF-TOF质谱技术对wild-type SC096和△ompP2缺失株进行比较蛋白组的研究，进一步探索生物学表型产生的原因。结果展示了58个显著上调或显著下调(1.5倍以上)的差异表达蛋白点，通过质谱鉴定，成功鉴定出55个显著差异蛋白。在△ompP2缺失株中，有32个蛋白是表达升高的，而23个是表达下降的。按照GO注释和COG分类，差异蛋白主要为糖代谢，转录翻译因子，脂类代谢，氨基酸代谢，核酸代谢和分子伴侣等，这表明差异蛋白主要参与细菌的能量代谢和细胞膜的合成等过程。以上结果揭示了缺失ompP2基因后生长缓慢和细胞形态变化的原因。因此，缺失ompP2基因导致了广泛的蛋白表达的改变，能为进一步解释△ompP2缺失株新生物学特性产生的原因和为研究OmpP2功能和分子机制提供了有价值的信息。　　4.RfaD，ThyA和Mip过量表达导致了△ompP2缺失株黏附入侵的升高　　从SC096株中提取纯化的OmpP2蛋白处理宿主细胞后，感染SC096菌株，观察细菌黏附和入侵的数量的变化。结果发现细菌黏附数和入侵数显著下降，表明OmpP2参与了H.parasuis对细胞的黏附入侵作用。既然OmpP2参与了黏附入侵机制，为什么ompP2基因缺失后黏附入侵会极显著的提高?预测可能是缺失后导致了某些参与黏附入侵相关蛋白的表达量升高而引起△ompP2缺失株黏附入侵能力的增加。从蛋白组学表达量升高的蛋白中发现了ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体(RfaD)，胸苷酸合成酶(ThyA)和巨噬细胞感染增强因子(Mip)可能参与了△ompP2缺失株的黏附入侵的作用。为了证实这一假设，利用已建立的自然转化方法，以SC096菌株为亲本株，分别构建了△rfaD，△thyA和△mip缺失株。检测黏附入侵能力的变化。结果发现△rfaD，△thyA和△mip缺失株的黏附入侵能力都显著的下降。再以△ompP2缺失株为亲本株，分别构建△ompP2△rfaD，△ompP2△thyA和△ompP2△mip双基因缺失株，检测其对宿主细胞的黏附入侵能力。结果发现双基因缺失株的黏附入侵能力也都显著的下降，有的甚至恢复到wild-type SC096株对宿主细胞的黏附或入侵的水平。以上结果证实了RfaD，ThyA和Mip调节了H.parasuis的黏附入侵作用，和RfaD，ThyA和Mip过量表达导致了△ompP2缺失株黏附入侵的升高。
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