Dulac细胞和PK-15细胞拯救嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的转染方法优化--《中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集》2014年
Dulac细胞和PK-15细胞拯救嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的转染方法优化
【摘要】：正引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)等相关疾病的重要病原。1991年该病在加拿大猪场暴发,我国于2000年证实有该病存在,自2004年PCV2灭活疫苗上市以来,疫苗防控猪圆环病毒相关疾病取得了巨大成就~([1,2])。本研究通过优化脂质体转染法和电穿孔转染法,将实验室构建的重组pSK-dPCV1-2质粒分别转染Dulac细胞和PK-15细胞,旨在提高嵌合型猪圆环病毒
【作者单位】：
【分类号】：S852.65【正文快照】：
引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)等相关疾病的重要病原。1991年该病在加拿大猪场暴发,我国于2000年证实有该病存在,自2004年PCV2灭活疫苗上市以来,疫苗防控猪圆环病毒相关疾病取得了巨大成就。本研究通过优化脂质体转染法和电穿孔转染法,将实验
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京公网安备75号猪圆环病毒2型不同基因型毒株的遗传变异、抗原表位及其致病性研究--《中国农业科学院》2012年博士论文
猪圆环病毒2型不同基因型毒株的遗传变异、抗原表位及其致病性研究
【摘要】：猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员,包括PCV1(Porcine circovirus type1, PCV1)和PCV2(Porcine circovirus type2.PCV2)两种基因型,其中PCV1为PK15细胞系的一种污染物,对猪无致病性；而PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。近年来PCV2已成为威胁世界养猪业的重要病原之一,并带来巨大的经济损失。目前国际上对PCV2命名进行规范(www.pcvd.net),主要分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三种基因型。猪群中PCV2a和PCV2b两种基因型广泛存在,自2004年以来主要以PCV2b基因型流行为主。PCV2c基因型仅二十世纪八十年代于丹麦报道,目前尚无流行。鉴于我国猪群PCV2感染广泛存在且危害严重,本研究对我国PCV2分子流行病学、抗原表位及其致病性进行系统研究,旨在为PCV2防控及致病机制研究奠定基础。
本研究对我国部分地区PCV2分子流行病学调查,分离到19个PCV2流行毒株。该19株病毒分为PCV2a、PCV2b和PCV2d三个基因型,各占10.5%、73.7%和15.8%,其中PCV2d为新出现的基因型。4株病毒为1766nt,以1767nt毒株为基准,其第39或1039位有1个碱基缺失后突变成1766nt毒株。对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现,有4株病毒编码基因发生了突变,出现了705nt和708nt两种突变型,使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸延伸。本试验选用AccⅠ和FbaⅠ内切酶对该19株病毒基因组PCR产物进行了限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP),结果表明该方法可作为流行毒株分型鉴别手段。研究表明,我国猪群中流行的PCV2毒株以PCV2b基因型为主,同时也出现了PCV2d新基因型及基因组为1766nt的变异毒株。此外,试验也证实上述毒株的ORF2编码Cap蛋白的C末端有突变现象,表明我国PCV2流行毒株呈现多样性。
PCV2-ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起免疫保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。5株单抗中有4株均属于同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,填补了核定位信号区抗原表位研究的空白,为进一步Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。
PCV2感染引起的相关疾病日益严重,流行毒株基因不断发生变异,根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型,还有PCV2d基因型新报道,这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株；拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50/mL;用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2)进行抗原捕获ELISA检测,拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应,另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应,表明属于不同基因型代表毒株。我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型,其病毒抗原特性各异,构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株,为进一步研究其致病性差异奠定了基础。
有关PCV2不同基因型自然重组的报道不断增多,其重组与病毒致病性和遗传进化关系尚不明确。本研究PK15细胞系模拟PCV2a和PCV2b不同基因型体外自然重组模型,选PCV2a基因型代表毒株PCV2a/CL1分别与两株PCV2b基因型代表毒株PCV2b/JF11和PCV2b/YJ进行共感染PK15,获得PCV2b(JF11)/2a(CL1)和PCV2b(YJ)/2a(CL1)两株不同基因型PCV2重组突变毒株,该重组突变毒株分别以其PCV2b基因型亲本毒为骨架,将其基因组位置1018nt～nt分别替换为亲本毒PCV2a/rCL的相应基因片段,体外试验表明,与其亲本毒相比,该两株重组突变毒株体外复制效率显著增强,其抗原性也发生明显改变。
为评价PCV2不同基因型、PCV2突变毒株及不同基因型PCV2重组毒株致病性差异,本研究分别选取PCV2不同基因型代表毒株PCV2a/rCL、PCV2b/rJF和PCV2d/rBDH; PCV2b基因型突变毒株PCV2b/rYJ;不同基因型PCV2重组代表毒株PCV2b(YJ)/2a(CL1)及其亲本毒进行动物感染试验,结果表明,与经典的PCV2a和PCV2b相比,新出现的PCV2d基因型PCV2d/rBDH及PCV2b突变毒株PCV2b/rYJ致病性显著增强(p0.05),PCV2a和PCV2b基因型间致病性差异不显著(p0.05)。此外,重组毒PCV2b(YJ)/2a(CL1)致病性与其亲本毒PCV2a/rCL1相似,但明显弱于其亲本毒PCV2b/rYJ(p0.05)。
有关PCV2致病机制尚不明确,本研究以非致病性PCV1基因组为骨架,分别替换PCV2-ORF2基因去除核定位信号区的相应基因片段及其相互重叠的截短基因片段,通过感染性克隆技术拯救嵌合病毒。对拯救的PCV嵌合病毒进行IPMA鉴定及测序,结果表明已成功获得3株PCV嵌合病毒,为进一步致病性研究奠定基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：S852.65【目录】：
摘要6-8Abstract8-22第一章 引言22-42 1.1 病原学22-24
1.1.1 分类22
1.1.2 理化特性22
1.1.3 基因组结构22-23
1.1.4 PCV流行病学23-24 1.2 PCV转录表达和复制24-27
1.2.1 PCV转录表达24-25
1.2.2 PCV复制酶复合体25-26
1.2.3 PCV复制26-27 1.3 PVC2感染27-30
1.3.1 PMWS起源27
1.3.2 PCV2感染的临床特征27-28
1.3.3 PCV2感染相关疾病28-29
1.3.4 PCV2感染的病理特征29-30 1.4 PCV2感染与宿主免疫30-31
1.4.1 PCV2感染途径及传播30
1.4.2 PCV2和宿主免疫30-31 1.5 PCV重组31-33
1.5.1 PCV2同种基因型间的重组31-32
1.5.2 PCV2不同基因型间的重组32
1.5.3 PCV1和PCV2间的重组32-33 1.6 PCV2诊断技术33-36
1.6.1 PMWS判断标准33
1.6.2 PCV2感染实验室诊断技术33-36 1.7 PCV2疫苗36-41
1.7.1 目前可用的商品化PCV2 疫苗36-37
1.7.2 试验 感染中商品化疫苗免疫效力37
1.7.3 免疫策略37-38
1.7.4 试验条件下PCV2新型疫苗38-41 1.8 研究的目的和意义41-42第二章 我国部分地区PCV2流行毒株遗传变异分析42-53 摘要42 2.1 材料和方法42-43
2.1.1 病料来源及病毒分离42
2.1.2 试剂及仪器42-43
2.1.3 引物设计和PCR扩增43
2.1.4 病毒基因组克隆及重组质粒鉴定43
2.1.5 病毒全长基因核苷酸序列测定与分析43
2.1.6 分离毒株基因组PCR-RFLP43 2.2 结果43-52
2.2.1 病毒基因克隆及鉴定43-45
2.2.2 病毒基因序列分析45
2.2.3 PCV2分离毒株基因型鉴 定45
2.2.4 碱基缺失与突变分析45-46
2.2.5 ORF2编码Cap蛋白序列分析46-48
2.2.6 遗传进化树的构建48-51
2.2.7 分离毒株基因分型51-52 2.3 讨论52-53第三章 PCV2-Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定53-63 摘要53 3.1 材料和方法53-56
3.1.1 PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的制备及标准毒株53-54
3.1.2 试剂及仪器54
3.1.3 Cap蛋白基因的截短扩增引物54-55
3.1.4 Cap蛋白截短表达载体的构建55
3.1.5 PCV2-Cap蛋白截短表达及Westernblot分析55
3.1.6 肽扫 描法抗原表位鉴定55-56
3.1.7 肽扫 描法抗原表位精确定位56
3.1.8 核心序列与PCV2阳性血清反应原性鉴定56 3.2 结果与分析56-61
3.2.1 Cap蛋白截短表达基因扩增及鉴定56-57
3.2.2 PCV2-Cap蛋白截短表达及Westernblot鉴定57-59
3.2.3 PCV2-CapA段合成肽抗原表位鉴定59-60
3.2.4 PCV2-CapA-b段合成肽抗原表位鉴定60
3.2.5 PCV2-CapA-b-1段合成肽抗原表位精确定位60
3.2.6 核心序列与PCV2阳性血清反应原性鉴定60-61 3.3 讨论61-63第四章 PCV2不同基因型毒株感染性克隆构建及生物学特性63-72 摘要63 4.1 材料与方法63-66
4.1.1 细胞、毒株、质粒及抗体63-64
4.1.2 试剂及仪器64
4.1.3 引物设计和PCR扩增64
4.1.4 病毒基因组克隆及重组质粒鉴定64
4.1.5 病毒基因组环化及DNA转染细胞64-65
4.1.6 克隆毒株的拯救及免疫学 鉴定65
4.1.7 克隆毒株电镜形态学观察65
4.1.8 克隆毒株基因组测序及PCR-RFLP 分析65
4.1.9 克隆毒株细胞传代毒价测定65
4.1.10 克隆毒株感染细胞动力学测定65
4.1.11 克隆毒株抗原性差异鉴定65-66 4.2 结果66-70
4.2.1 病毒感染性克隆的构建66
4.2.2 病毒的拯救及鉴定66-67
4.2.3 克隆毒株免疫电镜 察67
4.2.4 克隆毒株基因组测序及PCR-RFLP分析67-68
4.2.5 克隆毒株体外细胞传代毒价测定68-69
4.2.6 克隆毒株感染细胞动力学测定69
4.2.7 克隆毒株抗原性差异性分析69-70 4.3 讨论70-72第五章 PCV2a/2b/2d三种基因型毒株动物感染试验72-85 摘要72 5.1 材料和方法72-77
5.1.1 细胞和毒株72-74
5.1.2 试剂及仪器74
5.1.3 动物74
5.1.4 动物试验设计74-75
5.1.5 临床检查75
5.1.6 试验猪PCV2抗体检测75
5.1.7 PCV2病毒血症检测75
5.1.8 不同组织器官PCV2量检测75-76
5.1.9 致病性研究76
5.1.10 外周血白细胞亚群变化76
5.1.11 攻毒组组织病料PCV2基因组测序76
5.1.12 统计分析76-77 5.2 结果77-84
5.2.1 临床观察77-79
5.2.2 平均日增重(ADWG)79-80
5.2.3 病毒血症80
5.2.4 PCV2抗体检测80-81
5.2.5 荧光定量检测不同组织脏器中PCV2分布与载量81-82
5.2.6 病理损伤82
5.2.7 外周血免疫细胞亚群变化82-83
5.2.8 攻毒组PCV2序列印证83-84 5.3 讨论84-85第六章 PCV2a/2b基因型体外重组及其生物学特性研究85-96 摘要85 6.1 材料与方法85-88
6.1.1 细胞和病毒85
6.1.2 试剂及仪器85-86
6.1.3 PCV2a和PCV2b不同基因型毒株共感染试验86
6.1.4 重组病毒分离及鉴定86
6.1.5 重组病毒感染性克隆构建86
6.1.6 病毒形态学观察86
6.1.7 重组病毒与其亲本毒体外复制效率比较86-87
6.1.8 遗传进化树分析87
6.1.9 抗原性分析87
6.1.10 中和试验87-88 6.2 结果88-94
6.2.1 PCV2重组突变毒株分离88-89
6.2.2 重组病毒鉴定89-90
6.2.3 重组病毒拯救及鉴定90-91
6.2.4 形态学电镜观察91
6.2.5 PCV2重组病毒体外复制效率91-92
6.2.6 重组毒和亲本毒遗传进化分析92-93
6.2.7 重组毒株与亲本毒抗原性差异93-94
6.2.8 中和试验结果94 6.3 讨论94-96第七章 PCV2a与PCV2b基因型重组毒株动物感染试验96-109 摘要96 7.1 材料和方法96-100
7.1.1 细胞和毒株96-97
7.1.2 试剂及仪器97-98
7.1.3 动物98
7.1.4 动物试验设计98
7.1.5 临床检查98
7.1.6 PCV2抗体检测98-99
7.1.7 PCV2病毒血症检测99
7.1.8 不同组织器官PCV2定量检测99
7.1.9 致病性研究99-100
7.1.10 外周血白细胞亚群变化100
7.1.11 攻毒组病料PCV2基因组测序100
7.1.12 统计分析100 7.2 结果100-108
7.2.1 临床观察100-103
7.2.2 平均日增重（ADWG）103-104
7.2.3 病毒血症检测结果104
7.2.4 PCV2抗体检测104-105
7.2.5 荧光定量检测不同组织脏器中PCV2分布与载量105-106
7.2.6 病理损伤106-107
7.2.7 外周血免疫细胞亚群变化107
7.2.8 序列印证107-108 7.3 讨论108-109第八章 PCV1与PCV2嵌合型毒株的构建及鉴定109-115 摘要109 8.1 材料和方法109-112
8.1.1 细胞和毒株109-110
8.1.2 试剂及仪器110
8.1.3 重组质粒线性化和替换片段扩增110-111
8.1.4 重组嵌合质粒构建111
8.1.5 病毒基因组环化及DNA转染细胞111-112
8.1.6 克隆毒株的拯救及免疫学鉴定112
8.1.7 克隆毒株基因组测序112 8.2 结果112-113
8.2.1 嵌合病毒重组质粒的构建112-113
8.2.2 病毒的拯救及鉴定113 8.3 讨论113-115第九章 全文结论115-116参考文献116-135致谢135-136作者简历136博士期间发表文章136-137
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猪圆环病毒2型易感的PK15细胞系的克隆、筛选与鉴定
断奶仔猪多系统综合症(PMWS)是目前威胁全球养猪业的一种主要疾病。目前普遍认为引起PMWS的病原为猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV2是猪圆环病毒(PCV)两种基因型中的一种，为小颗粒、无包膜、环状单股DNA病毒，属环状病毒科，能持续感染猪肾细胞系(PK15)。病毒基因组有两个主要的开放阅读框(ORFs),分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。使用PCV2抗原制成的疫苗在对PMWS的预防中初见成效。随着针对PCV2引起的PMWS及其它疾病的疫苗和诊断剂的形成与发展，我们需要有效可靠的方法来获取足量的PCV2病毒。各实验室培养PCV2均在猪肾细胞系PK15上进行。但是，PK15细胞培养的PCV2的病毒滴度，仅在10-4-10-5 TCID50/ml之间。免疫荧光染色显示接种PCV2的PK15细胞中仅有20％的细胞对PCV2易感。
本研究通过对PK15母细胞进行有限稀释和细胞克隆，得到对PCV2具有高敏感性的PK15-B1细胞系，并对其相关特性及稳定性作了一系列鉴定。
本研究内容分为以下2个部分：
1.PCV2增殖敏感的PK15-B1细胞的克隆、筛选与生物学特征测定
为获得高滴度的PCV2病毒，本研究采用有限稀释法，将可以适应PCV2增殖的PK15细胞系进行克隆，获得5个PK15单细胞克隆，分别为B1、c5、E6、E2和B10。接种105.0TCID50/ml PCV237℃培养24h，用IFA法检测PCV2增殖情况。结果显示，B1克隆细胞PCV2荧光细胞数量最多，而C5克隆细胞荧光细胞数量最少。取B1细胞传代培养，50代内生长稳定，并对其细胞形态进行了观察比较，发现PK15-B1细胞要比PK15母细胞及PK15-C5细胞圆滑，接毒后细胞状态也会受一定影响。B1、C5和PK15母细胞三种细胞接种等量PCV2培养，收获病毒液测定其TCID50，结果分别为10-7、10-2和10-5TCID50/ml。用Real-time PCR方法检测细胞内病毒增殖规律，发现B1细胞株中PCV2的含量始终最高，且在72h达到峰值，可见PK15-B1细胞最适合PCV2增殖。另外，该实验还分别选取了5、10、20和50代的B1细胞接种105.0TCID50/rril PCV2，再用IFA法检测病毒在该细胞系中增殖的稳定性，结果显示该细胞能稳定产生高滴度PCV2。
2.PK15-B1细胞外源微生物的检测
为确保该细胞系在疫苗、诊断试剂和治疗手段研究等后续应用，我们分别选择第20、30和50代对其部分外源微生物进行了检测。结果为：①用PCR/RT-PCR方法检测外源病毒猪圆环病毒1型(PCV1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(HCV)和脑心肌炎病毒(EMCV)，结果均为阴性；②用支原体营养肉汤培养和支原体营养琼脂培养检测支原体，结果支原体检验液体培养均无颜色变化，固体培养未出现支原体菌落；③将细胞悬液取少量分别接种于营养肉汤培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基中，并将每种培养基分别置于37℃和25℃培养3-5d，进行细菌和真菌的检测，结果均未观察到菌落生长。该结果表明PK15-B1纯净，不存在细菌、真菌、支原体污染，且无PCV1、BVDV、HCV、EMCV等外源微生物污染。
学科专业：
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学位授予单位：
导师姓名：
学位年度：
S852.659.2
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