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【求助】冰冻切片掉片子了，如何补救？
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这个帖子发布于8年零9天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
小弟最近切了一批小鼠皮肤的冰冻切片，自认为切的形态很好，可是准备做免疫荧光的时候傻眼了，切片一入PBS就全都掉了，那个心疼啊!我做的过程大概如下：新鲜取材，4%多聚甲醛4度固定24h，30%蔗糖脱水24h，OTC包埋切片，用涂有多聚赖氨酸的玻片黏片，室温晾干，-20 度切片盒中保存(没有如园友所说密封)。开始做免疫荧光时，直接取出，自然晾干，入PBS，就是在这一步，片子全掉了！！！片子的清洗，涂片应该没有问题，因为石蜡不掉片。我认为是在-20 度保存的问题。在此请教各位园友，我这批切片还有何补救措施？请各路高人指点，我没有更多的标本再重新切了。
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cdh527 2.切片贴片后建议在37度烤箱里放30-60分钟，效果比较好。3.保存的玻片取出前应先转入4度60分钟，再转至室温条件中30分钟，方可开盒取片。原因分析如下：1、冰冻切片的组织标本制备有问题。冰冻切片前的组织要么是新鲜组织直接用OCT包埋后，几分钟后在-22度切片即可（或者放入液氮中存放后再切片）。切好的切片晾干后再用冰丙酮固定5-10min，自然晾干后-20度密封保存。而你是用4%多聚甲醛固定后再切片，这是石蜡切片的组织标本制备。建议尝试的我的方法（许多文献支持）。2、载玻片的清洗干净和防脱片处理，这也很重要。3、组织切片太厚、刀片不锋利、挡板有问题等等也是脱片的可能原因。4、我反对cdh527战友的第二和第三条建议，因为这是针对石蜡切片脱片原因的分析。第一个原因必须重点排除，顺祝你试验早日成功!!
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粘片的时候展片都展平了么？如果里面有气泡也很容易掉篇的。多聚甲醛4-6小时就可以了，过夜也行，不知道24小时是不是长了一点，不过好像也不应该影响到你的掉片-20度保存不会影响到掉片子的问题吧。。。如果都掉片子的话，可以把片子放到pbs里面，看可否把组织完整的与片子分离开，如果可以的话，就让组织在pbs里展开，然后还可以用别的片子粘片试试看。。。这只是假设的方法，不知道行不行的通，可以拿一两张片子试试看
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切出来的片子确实有点卷，抗卷板好像不能很好的work，但是片子粘上了之后观察形态，还是很好的，皮肤也没有褶皱，当时也就没有在意片子有点卷的问题了，个人觉得除了组织之外的OTC卷应该没有多大的影响吧。tuotuojoin提到重新粘片的方法我一定会去试试的，非常感谢！继续求其他的方法。
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分析可能原因如下：1.玻片有问题。可能玻片预处理得不好；铺片材料质量不好，铺胶之间一定要烤干。2.切片贴片后建议在37度烤箱里放30-60分钟，效果比较好。3.保存的玻片取出前应先转入4度60分钟，再转至室温条件中30分钟，方可开盒取片。4.PBS润洗轻柔点，一般来说影响不大。以上是个人看法，供参考。
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我今天把片子从-20度拿出来后，试了在37度烤3个小时，也试了在60度烤1个小时，可是一入PBS还是掉片！cdh527园友说的要“先转入4度60分钟，再转至室温条件中30分钟”，我再去试试。谢谢
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cdh527 2.切片贴片后建议在37度烤箱里放30-60分钟，效果比较好。3.保存的玻片取出前应先转入4度60分钟，再转至室温条件中30分钟，方可开盒取片。原因分析如下：1、冰冻切片的组织标本制备有问题。冰冻切片前的组织要么是新鲜组织直接用OCT包埋后，几分钟后在-22度切片即可（或者放入液氮中存放后再切片）。切好的切片晾干后再用冰丙酮固定5-10min，自然晾干后-20度密封保存。而你是用4%多聚甲醛固定后再切片，这是石蜡切片的组织标本制备。建议尝试的我的方法（许多文献支持）。2、载玻片的清洗干净和防脱片处理，这也很重要。3、组织切片太厚、刀片不锋利、挡板有问题等等也是脱片的可能原因。4、我反对cdh527战友的第二和第三条建议，因为这是针对石蜡切片脱片原因的分析。第一个原因必须重点排除，顺祝你试验早日成功!!
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我遇到过同样的问题，后来就不再直接贴片，而是做free floating，切片后直接放入PBS，然后用毛笔捞出贴片，室温干燥5分钟后，再也没有掉过。固定，脱水步骤与你完全相同，因此考虑是OCT的原因。现在10，20，50，100微米的片子都是这样做的。对于现有的切片，支持tuotuojoin的意见。
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终于等到扬子鳄来回答了，我还给你PM了呢:)，非常感谢！我之所以用先固定，再蔗糖脱水，然后包埋切片的方法，是因为：1.我用别人实验室的切片机，如果用你的方法的话，需要把组织置于液氮中带过去，挺麻烦；2. 我以前用我自己描述的方法做过，周围的老师们也这样做，没有问题，只是这次遇到麻烦了，故认为应该不是前面的操作导致掉片的，原因可能在后面，比如粘片、晾干、保存等步骤。用同样的片子做石蜡切片，没有掉片，故认为可以排除片子没洗干净、粘片剂没涂好等原因。By the way，扬子鳄，我下次准备换你推荐的方法进行材料的处理，请问：是取材之后放入液氮中速冻，再用OTC包埋吗？听说组织不能直接放入液氮中，只能置于小盒子里放在液氮表面速冻，是这样的吗？
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问题解决了，在冷丙酮里后固定10min，晾干后再IF，掉片少多了
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不用找了，就一个原因，玻片的品质我遇到过这个问题，切了好多片子，一盒没够，又换一盒，两盒不是一个公司的，VWR的全掉了（该片做石蜡完全没问题），Fisher的一点没掉。确实是贵了点，贵有贵的道理。
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应该是玻片处理有问题我自己处理过的载玻片从来不掉片子只是用普通的明胶而已，呵呵我们一直都是用漂浮法做冰冻切片蛮不错的
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我感觉还是切片子有问题，我们用APES（防脱片剂）处理的载玻片一直效果不错，冰冻切片做免疫组化和原位杂交一直不掉片子。像你这样的问题，可以试一试把你切完的片子，晾干，用APES再浸泡一下子，再晾干，水洗三次，接着做，看一看能否不掉片子
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弱弱的问一句：OTC是什么？？谢谢
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Tissue-Tek OCT compound to bind tissue to the specimen block
and to surround and cover the tissue specimen.Freeze to optimal cutting tempreture(OCT). This is water soluble and leaves no residue to discolor section or slide.
Contents: 10.24% w/w polyvinyl alcohol, 4.26% w/w polyethlene glycol, 85.50% w/w nonreactive ingredients.
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呵呵，这样解决问题好开心哦
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【求助】我想做冰冻切片的免疫荧光，如果组织直接冻到-80℃后该如何处理
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这个帖子发布于2年零17天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
有谁做冰冻切片啊
我马上要做冰冻切片免疫荧光， 但是我收集的标本被直接冻-80℃冰箱里了，那么接下来改如何处理呢 ？非常急啊，感谢给位大侠给我指引啊！
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直接冻-80℃，会形成很多小冰晶啊，对组织的形态和抗原损伤都很大。如果你还是想做冰冻切片的话，只能试试了。加包埋剂包埋起来，不然没法切
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祈求上苍庇佑吧！可拿来做基因蛋白之类的研究。但要做形态学的话，还是重新取材吧。
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直接丢在包埋剂里面，放-20度，然后切片就可以了。我们这样试过肝组织样本，是没有太大问题的。你也可以尝试一下。
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直接取出后，冰冻切片用的包埋剂包埋，然后直接切片后贴在在玻片上。冷丙酮固定10min。晾干后（等丙酮挥发完毕），放在-80度保存。用时取出即可。但是这样可能组织形态不太好。建议你做荧光，可能比组化要好一些，还简单。下一次取材之前一定要根据实验目的选择材料保存方法，祝好运。
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刚看到有人把肝脏直接丢-80做冰冻切片效果还不错。你照楼上的建议试试吧！
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我直接丢在液氮保存，切的时候取出放冰上，切前没有包埋和固定，切片老师说的，但是做的效果不好，是不是标本处理有问题
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&&冰​冻​切​片​是​将​组​织​直​接​冰​冻​进​行​切​片​,​是​一​种​简​便​快​速​的​方​法​,​常​常​用​于​配​合​临​床​手​术​等​在​短​时​间​内​制​出​切​片​的​病​理​急​诊​。​由​于​冰​冻​切​片​组​织​不​需​经​过​酒​精​脱​水​、​二​甲​苯​透​明​和​包​埋​等​过​程​,​脂​肪​、​类​脂​质​、​抗​原​等​化​学​物​质​成​分​不​受​影​响​,​因​此​是​临​床​上​常​用​的​制​片​方​法​。
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