茶树花多糖的提取、纯化、结构鉴定及生物活性的研究_博士论文_学位论文
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茶树花多糖的提取、纯化、结构鉴定及生物活性的研究
关键词: &&&&&&&
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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茶树花富含营养成分和活性物质,是一类具重要的潜在资源。本文在系统研究茶叶多糖、理化性质和一级结构的基础上,利用生物大分子研究的近代最新技术和现代分离、分析手段与药理实验方法,表征茶树花多糖的溶液行为和三维链构象,尝试揭示多糖的高级结构与其重要生物活性的关系。茶树花多糖的提取主要包括茶树花多糖提取条件的优化和茶树花多糖脱蛋白,脱色等方法的选择。采用单因素实验和Box-Behnken中心组合设计实验,确定了热水提取茶树花多糖最佳提取条件：21.75倍量水,90。C提取1.89h。通过综合考量Sevag法、三氯乙酸法、盐酸法和氯化钙法的脱蛋白率和多糖保留量,确定了以Sevag法作为茶树花多糖脱蛋白的方法。实验还比较了活性炭吸附法,H2O2氧化法和溶剂洗涤法的脱色效果,活性炭吸附法能够得到较高的脱色率和多糖保留量。经Sephadex G-100凝胶柱层析分离得到多糖组分TFP-1和TFP-2,冷冻干燥后为灰白色粉末,多糖含量为83.6%和87.9%,蛋白含量为1.5%和2.9%,糖醛酸含量为2.7%和7.1%。高效液相凝胶色谱法分析茶树花多糖组分TFP-1和TFP-2,得到TFP-1的分子量为167.5kDa,单糖组成葡萄糖：木糖：鼠李糖：半乳糖=1.0：1.2：0.81：0.98。TFP-2分子量为10.1kDa,单糖组成葡萄糖：木糖：鼠李糖：阿拉伯糖=1.0：0.76：2.3：2.3。多糖的初步分析显示,TFP-1和TFP-2是水溶性、非淀粉、非酚类物质,不含还原糖和核酸、含有蛋白质的多糖。β-消去反应表明TFP-1和TFP-2中糖链与蛋白质之间通过0-糖肽键相连。通过红外光谱分析得出TFP-1和TFP-2具有典型的糖类化合物的光谱特征,TFP-1同时含有α-吡喃环以及β-吡喃环的特征吸收峰,而TFP-2只含有α-吡喃环的特征吸收峰。1H NMR中的化学位移显示TFP-1含有α-D-Galp、α-D-GalpNAc、α-D-Xylp、α-D-Glcp和β-D-Glcp残基,而TFP-2含有α-L-Arap、α-D-Glcp、α-D-Xylp和α-D-GlcpNAc残基。原子力显微镜(AFM)的图像显示,茶树花多糖链分子间互相缠绕,在浓度为5μg/mL下TFP-1和TFP-2直径为250nm和150nm,在浓度为20μg/mL时直径增加为500nm和200nm。茶树花粗多糖TFP及组分TFP-1和TFP-2在水溶液中表现为剪切变稀,在相同的剪切速率下,茶树花多糖溶液粘度TFP&TFP-1&TFP-2。通过激光光散射、粘度测定和刚果红反应等方法确定了茶树花多糖在0.1MNaCl水溶液中呈现球状构象,且分枝较多。pH值、温度、离子强度等环境因素的改变均影响其立体构象。扫描电镜SEM观察和X-射线衍射分析表明TFP-1和TFP-2为无定形结构,提示多糖的空间结构和溶液行为将明显影响多糖的生物活性。系统的研究了茶树花多糖的体外和体外活性。通过比较茶树花粗多糖TFP及组分TFP-1和TFP-2对羟基自由基,超氧阴离子自由基以及DPPH自由基的清除活性,得出抗氧化活性TFP-2&TFP-1&TFP,这可能与组成多糖的成分及水溶性和粘度有关。灌胃茶树花多糖(75、150和300mg/kg) 28d后可抑制溴化苯诱导的小鼠肝脏脂质过氧化,能显著提高小鼠SOD活性和T-AOC水平,并且抑制MDA含量的升高。灌胃茶树花多糖(75、150和300mg/kg)14d后能显著增加正常小鼠巨噬细胞的吞噬活性,对二硝基甲苯诱导的小鼠迟发型超敏反应也有显著的增强。对S180肉瘤小鼠的研究发现,灌胃TFP(75、150和300mg/kg) 7d后能显著改善荷瘤小鼠生活状况,显著增加荷瘤小鼠生存时间和存活率,抑瘤率分别为45.5%,60.9%和64.5%。能显著增加荷瘤小鼠血清中IFN-γ和IL-2含量的影响,并且能增加T细胞亚群CD4+的数量及改善CD4+/CD8-的失调,提示摄入茶树花多糖可明显增强免疫活性。茶树花多糖对四氧嘧啶引起的小鼠实验性糖尿病有明显的防治作用。灌胃茶树花多糖(75、150和300mg/kg)21d后,能明显改善糖尿病小鼠的“三多一少”状况,显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖(p&0.01)。茶树花多糖在体外可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性,在0.2-2.0mg/mL浓度范围内呈量效关系。
摘要&&14-16Abstract&&16-20第一章 绪论&&20-43&&1.1 茶树花的概况&&20-24&&&&1.1.1 茶树花的研究现状&&21-23&&&&&&1.1.1.1 茶树花中的多糖&&21-22&&&&&&1.1.1.2 茶树花中的多酚&&22&&&&&&1.1.1.3 茶树花中的黄酮类&&22&&&&&&1.1.1.4 茶树花中的SOD&&22-23&&&&&&1.1.1.5 茶树花中的香精&&23&&&&1.1.2 茶树花产品的开发&&23-24&&&&&&1.1.2.1 花茶的制备&&23&&&&&&1.1.2.2 酒类产品的开发&&23&&&&&&1.1.2.3 茶树花饮料的开发&&23-24&&&&&&1.1.2.4 茶树花粉的应用&&24&&1.2 糖类研究历史&&24-25&&1.3 多糖的提取、和&&25-29&&&&1.3.1 多糖的提取&&25-26&&&&&&1.3.1.1 溶剂提取法&&25&&&&&&1.3.1.2 酶法提取&&25-26&&&&&&1.3.1.3 超声波提取&&26&&&&&&1.3.1.4 微波提取&&26&&&&&&1.3.1.5 超临界流体萃取法&&26&&&&1.3.2 多糖的提纯&&26-29&&&&&&1.3.2.1 多糖除蛋白&&26-27&&&&&&1.3.2.2 多糖除色素&&27&&&&&&1.3.2.3 多糖的纯化&&27-28&&&&&&1.3.2.4 多糖含量的测定&&28&&&&&&1.3.2.5 多糖的摩尔质量测定&&28-29&&1.4 多糖的结构分析&&29-35&&&&1.4.1 多糖一级结构分析&&29-33&&&&&&1.4.1.1 水解法&&29-30&&&&&&1.4.1.2 高碘酸氧化和smith降解&&30&&&&&&1.4.1.3 甲基化反应&&30&&&&&&1.4.1.4 紫外分析法(UV)&&30-31&&&&&&1.4.1.5 红外光谱法(IR)&&31&&&&&&1.4.1.6 气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)&&31&&&&&&1.4.1.7 核磁共振(NMR)&&31-32&&&&&&1.4.1.8 质谱法(MS)&&32&&&&&&1.4.1.9 毛细管电泳(CE)&&32-33&&&&&&1.4.1.10 酶学方法&&33&&&&&&1.4.1.11 免疫学方法&&33&&&&1.4.2 多糖的高级结构(构象)研究&&33-35&&&&&&1.4.2.1 原子力显微镜(AFM)&&33-34&&&&&&1.4.2.2 电子显微镜(EM)&&34&&&&&&1.4.2.3 X-射线衍射法&&34&&&&&&1.4.2.4 圆二色谱(CD)&&34&&&&&&1.4.2.5 理论算法研究多糖的构象&&34-35&&1.5 多糖的药理作用&&35-39&&&&1.5.1 多糖的作用&&35-36&&&&1.5.2 多糖的作用&&36-37&&&&1.5.3 多糖的作用&&37&&&&1.5.4 多糖的降血脂作用&&37-38&&&&1.5.5 多糖的作用&&38&&&&1.5.6 多糖的抗病毒作用&&38&&&&1.5.7 多糖的抗辐射作用&&38-39&&&&1.5.8 多糖的其他作用&&39&&1.6 多糖的结构与其生物活性的关系&&39-41&&&&1.6.1 多糖的组成对生物活性的影响&&39&&&&1.6.2 多糖的糖苷键类型对生物活性的影响&&39-40&&&&1.6.3 多糖的分子量对生物活性的影响&&40&&&&1.6.4 多糖的取代基团对生物活性的影响&&40-41&&&&1.6.5 多糖的溶解度对生物活性的影响&&41&&&&1.6.6 多糖的空间结构对生物活性的影响&&41&&1.7 本课题研究目的意义&&41-43第二章 茶树花多糖的提取工艺研究&&43-58&&2.1 材料&&43&&&&2.1.1 实验材料&&43&&&&2.1.2 主要试剂及仪器&&43&&2.2 实验方法&&43-49&&&&2.2.1 茶树花多糖的提取&&43-44&&&&2.2.2 热水浸提的单因素实验&&44&&&&&&2.2.2.1 不同料液比对多糖提取率影响的比较&&44&&&&&&2.2.2.2 不同提取温度对提取率影响的比较&&44&&&&&&2.2.2.3 不同提取时间对提取得率影响的比较&&44&&&&2.2.3 Box-Behnken中心组合设计实验优化提取参数&&44-45&&&&2.2.4 茶树花多糖含量的测定&&45-46&&&&2.2.5 茶树花多糖糖醛酸含量的测定&&46-47&&&&2.2.6 脱蛋白方法的比较&&47&&&&&&2.2.6.1 氯化钙法&&47&&&&&&2.2.6.2 盐酸法&&47&&&&&&2.2.6.3 三氯乙酸法&&47&&&&&&2.2.6.4 Sevag法&&47&&&&2.2.7 茶树花多糖蛋白含量的测定&&47-48&&&&2.2.8 多糖脱色方法的比较&&48&&&&2.2.9 Sephadex G-100纯化&&48-49&&&&2.2.10 统计学分析&&49&&2.3 结果与分析&&49-57&&&&2.3.1 提取条件对TFP提取率的影响&&50-51&&&&&&2.3.1.1 提取液料比对TFP提取率的影响&&50&&&&&&2.3.1.2 提取温度对TFP提取率的影响&&50-51&&&&&&2.3.1.3 提取时间对TFP提取率的影响&&51&&&&2.3.2 Box-Behnken中心组合设计实验优化提取参数&&51-55&&&&2.3.3 不同脱蛋白方法的比较&&55&&&&2.3.4 不同脱色方法的比较&&55-56&&&&2.3.5 茶树花多糖含量的测定&&56&&&&2.3.6 茶树花多糖中糖醛酸含量的测定&&56&&&&2.3.7 茶树花多糖中蛋白含量的测定&&56&&&&2.3.8 茶树花多糖的分离纯化&&56-57&&2.4 小结&&57-58第三章 茶树花多糖的理化性质及结构研究&&58-87&&3.1 材料&&58-59&&&&3.1.1 实验材料&&58&&&&3.1.2 主要试剂及仪器&&58-59&&3.2 实验方法&&59-63&&&&3.2.1 颜色反应&&59&&&&&&3.2.1.1 碘-碘化钾反应&&59&&&&&&3.2.1.2 费林试剂反应&&59&&&&&&3.2.1.3 茚三酮反应&&59&&&&&&3.2.1.4 三氯化铁反应&&59&&&&&&3.2.1.5 双缩脲反应&&59&&&&3.2.2 溶解度测定&&59&&&&3.2.3 比旋度测定&&59-60&&&&3.2.4 摩尔质量测定&&60&&&&3.2.5 单糖组成分析&&60&&&&3.2.6 氨基酸组成分析&&60-61&&&&3.2.7 β-消去反应&&61&&&&3.2.8 红外光谱分析&&61&&&&3.2.9 核磁共振(NMR)分析&&61&&&&3.2.10 晶体特性测定&&61&&&&3.2.11 热特性测定&&61&&&&3.2.12 扫描电子显微镜(SEM)分析&&61-62&&&&3.2.13 原子力显微镜(AFM)分析&&62&&&&3.2.14 刚果红实验&&62&&&&3.2.15 流变特性分析&&62&&&&3.2.16 不同外界因素对茶树花多糖紫外吸收光谱的影晌&&62&&&&3.2.17 粒度分布测定&&62-63&&&&3.2.18 激光光散射测定&&63&&&&3.2.19 粘度的测定&&63&&3.3 结果与分析&&63-84&&&&3.3.1 颜色反应&&63&&&&3.3.2 溶解度测定&&63-64&&&&3.3.3 比旋度测定&&64&&&&3.3.4 茶树花多糖分子量的测定&&64-65&&&&3.3.5 茶树花多糖单糖组成分析&&65-66&&&&3.3.6 氨基酸组成分析&&66&&&&3.3.7 β-消去反应&&66-67&&&&3.3.8 茶树花多糖红外光谱分析&&67-68&&&&3.3.9 茶树花多糖的~1H NMR分析&&68-70&&&&3.3.10 X-射线衍射仪测定结晶性能&&70-71&&&&3.3.11 茶树花多糖的热特性&&71-73&&&&3.3.12 茶树花多糖的SEM分析&&73&&&&3.3.13 茶树花多糖的AFM分析&&73-75&&&&3.3.14 刚果红实验分析&&75-76&&&&3.3.15 茶树花多糖流变学分析&&76-77&&&&3.3.16 不同外界因素对茶树花多糖紫外吸收光谱的影响&&77-79&&&&&&3.3.16.1 温度对茶树花多糖构象的影响&&77&&&&&&3.3.16.2 pH值对茶树花多糖构象的影响&&77-78&&&&&&3.3.16.3 钙离子对茶树花多糖构象的影响&&78-79&&&&3.3.17 茶树花多糖粒度测定&&79-80&&&&3.3.18 动静态激光光散射测定&&80-83&&&&&&3.3.18.1 静态激光光散射测定&&80-81&&&&&&3.3.18.2 动态激光光散射测定&&81-83&&&&3.3.19 茶树花多糖特性粘数测定&&83-84&&3.4 讨论&&84-86&&&&3.4.1 茶树花多糖分子量及单糖组成&&84-85&&&&3.4.2 茶树花多糖中多糖与蛋白的连接&&85&&&&3.4.3 茶树花多糖的电镜观察和固态结构&&85&&&&3.4.4 茶树花多糖分子的构象&&85-86&&3.5 小结&&86-87第四章 茶树花多糖抗氧化活性的研究&&87-102&&4.1 材料&&87-88&&&&4.1.1 实验材料&&87-88&&&&4.1.2 主要试剂及仪器&&88&&4.2 实验方法&&88-91&&&&4.2.1 茶树花多糖体外清除自由基&&88-89&&&&&&4.2.1.1 茶树花多糖对O_2?~-自由基的清除&&88&&&&&&4.2.1.2 茶树花多糖对?OH自由基的清除&&88-89&&&&&&4.2.1.3 茶树花多糖对DPPH自由基的清除&&89&&&&4.2.2 茶树花多糖对溴化苯诱导小鼠的影响&&89-91&&&&&&4.2.2.1 小鼠血清中SOD活性测定&&89&&&&&&4.2.2.2 小鼠肝组织匀浆中SOD活性测定&&89-90&&&&&&4.2.2.3 小鼠肝组织匀浆中T-AOC活性测定&&90&&&&&&4.2.2.4 小鼠肝组织匀浆中MDA含量测定&&90&&&&&&4.2.2.5 小鼠血清中MDA含量测定&&90-91&&&&&&4.2.2.6 小鼠红细胞抽提液中MDA含量测定&&91&&&&4.2.3 统计学分析&&91&&4.3 结果与分析&&91-98&&&&4.3.1 TFP,TFP-1和TFP-2对O_2?~-自由基的清除活性&&91-92&&&&4.3.2 TFP,TFP-1和TFP-2对?OH自由基的清除活性&&92-94&&&&4.3.3 TFP,TFP-1和TFP-2对DPPH自由基的清除活性&&94-95&&&&4.3.4 茶树花多糖对溴化苯诱导的小鼠肝脏匀浆中MDA含量的影响&&95&&&&4.3.5 茶树花多糖对溴化苯诱导的小鼠血清中MDA含量的影响&&95-96&&&&4.3.6 茶树花多糖溴化苯诱导的小鼠红细胞抽提液中MDA含量的影响&&96-97&&&&4.3.7 茶树花多糖对溴化苯诱导的小鼠肝脏匀浆中SOD含量的影响&&97&&&&4.3.8 茶树花多糖对溴化苯诱导的小鼠血清SOD含量的影响&&97-98&&&&4.3.9 茶树花多糖对溴化苯诱导的小鼠肝脏T-AOC的影响&&98&&4.4 讨论&&98-101&&&&4.4.1 茶树花多糖对抗氧化酶系和MDA的影响&&99-100&&&&4.4.2 茶树花多糖抗氧化作用的机理&&100&&&&4.4.3 多糖分子特性与抗氧化活性的关系&&100-101&&4.5 小结&&101-102第五章 茶树花多糖抗肿瘤及免疫调节活性的研究&&102-119&&5.1 材料&&102&&&&5.1.1 实验材料&&102&&&&5.1.2 主要试剂及仪器&&102&&5.2 实验方法&&102-106&&&&5.2.1 荷瘤小鼠模型制备&&102-103&&&&5.2.2 实验小鼠的生存情况观察&&103&&&&5.2.3 茶树花多糖抑瘤率测定&&103&&&&5.2.4 荷瘤小鼠存活率的影响&&103-104&&&&5.2.5 荷瘤小鼠胸腺指数、脾脏指数测定&&104&&&&5.2.6 细胞因子及T细胞亚群的测定&&104-105&&&&5.2.7 正常小鼠碳粒廓清速率的影响&&105&&&&5.2.8 正常小鼠迟发型超敏反应(DTH)&&105-106&&&&5.2.9 统计学分析&&106&&5.3 结果与分析&&106-112&&&&5.3.1 荷瘤小鼠体重及生活状况&&106-107&&&&5.3.2 茶树花多糖对S180小鼠抑瘤率的影响&&107-108&&&&5.3.3 茶树花多糖对荷瘤小鼠存活率的影响&&108-109&&&&5.3.4 对免疫器官脏器指数的影响&&109&&&&5.3.5 对细胞因子及T细胞亚群水平的影响&&109-111&&&&&&5.3.5.1 茶树花多糖对血清中IL-2含量的影响&&109-110&&&&&&5.3.5.2 茶树花多糖对血清中IFN-γ含量的影响&&110-111&&&&&&5.3.5.3 茶树花多糖对T细胞亚群含量的影响&&111&&&&5.3.6 茶树花多糖对正常小鼠碳廓清速率的影响&&111-112&&&&5.3.7 茶树花多糖对小鼠迟发型超敏反应的影响&&112&&5.4 讨论&&112-118&&&&5.4.1 肿瘤模型的选择&&113&&&&5.4.2 免疫器官&&113-114&&&&5.4.3 巨噬细胞的吞噬指数&&114&&&&5.4.4 迟发型超敏反应(DTH)&&114-115&&&&5.4.5 细胞因子&&115-116&&&&&&5.4.5.1 白介素-2(IL-2)&&115-116&&&&&&5.4.5.2 γ-干扰素(IFN-γ)&&116&&&&5.4.6 T细胞亚群&&116-117&&&&5.4.7 影响多糖抗肿瘤作用的因素&&117-118&&5.5 小结&&118-119第六章 茶树花多糖降血糖活性研究&&119-127&&6.1 材料&&119-120&&&&6.1.1 实验材料&&119&&&&6.1.2 主要试剂及仪器&&119-120&&6.2 实验方法&&120-121&&&&6.2.1 TFP-2对α-淀粉酶的抑制活性&&120&&&&6.2.2 TFP-2对α-葡萄糖苷酶的抑制活性&&120-121&&&&6.2.3 小鼠急性毒性实验&&121&&&&6.2.4 糖尿病小鼠模型的建立及分组方法&&121&&&&6.2.5 统计学处理&&121&&6.3 结果与分析&&121-125&&&&6.3.1 TFP-2对α-淀粉酶的抑制活性&&121-122&&&&6.3.2 TFP-2对α-葡萄糖苷酶的抑制活性&&122-123&&&&6.3.3 小鼠急性毒性实验&&123&&&&6.3.4 四氧嘧啶高血糖小鼠模型&&123&&&&6.3.5 TFP-2对糖尿病小鼠外观状况的影响&&123-124&&&&6.3.6 TFP-2对糖尿病小鼠体重的影响&&124&&&&6.3.7 TFP-2对四氧嘧啶血糖小鼠空腹血糖的影响&&124-125&&6.4 讨论&&125-126&&6.5 小结&&126-127参考文献&&127-137作者简历&&137-138致谢&&138
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茶树花大曲的制作工艺研究
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大曲是酿制中国大曲白酒用的一种糖化剂和发酵剂，在实际生产过程中主要依靠
周围环境中的微生物，在淀粉质的原料中竞争生存，适应制曲环境的微生物存活后，
进行富集、繁殖和增殖而制成，这个过程保藏了可用于酿酒的有益微生物。大曲一般
为砖块形的粗酶制剂，有着提供菌源、糖化发酵、投粮生香的功能，其品质对出酒率
和酒的品质有着显著影响。茶树花是茶树的生殖器官，具有花期长、寿命短、结实少
的特点，且资源丰富。其化学成分与茶叶相似，富含多种有益活性成分,对人体具有
解毒、抗氧化、抗衰老、抑癌等功效，有着广阔的应用前景。
茶树花是2013 年被卫生部批准的一种新资源食品，相关的研究尚处于探索阶段。
由于茶树花具有香气浓郁的特点，故本研究尝试将茶树花与传统大曲制作相结合，制
成一种新型大曲,再将此曲应用于固态白酒的酿造，以期得到一种香气新颖的白酒。
论文以小麦为原料，并加入茶树花、母曲，采用传统大曲制作工艺进行制曲。通
过对茶树花大曲制作过程中茶树花添加量、母曲添加量、水添加量、制曲时间等主要
因素进行研究，并应用正交实验法对茶树花大曲的制曲工艺参数进行优化，确定了最
佳的制曲工艺。结果表明：在茶树花添加量为2.0g/100g 小麦，母曲添加量3.0g/100g
小麦，水添加量45mL/100g
小麦，制曲时间25d
的条件下，所制的茶树花大曲表面
均匀挂衣，无裂口，断面整齐，火圈明显，曲香浓郁，无杂味。所制成品曲的理化及
微生物指标为：水分含量12.5g/100g，酸度0.9mmol/10g ，淀粉含量52.53g/100g，糖
mg/g·h ，液化力1.1g/g·h ，发酵力57gCO /100g ·48h ，霉菌9.8×10 cfu/g，
酵母菌9.4×10 cfu/g，细菌5.7×10 cfu/g 。应用顶空吸附与GC-MS 相结合的方法对茶
树花大曲主要香气组分进行了检测。结果表明，茶树花大曲的香气成分有48 种，包
括：醇类、醛类、酮类、烷炔类、萜烯类、含氮类、酸类、芳香族类、酚类、酯类以
及呋喃等。与未加茶树花所制大曲以及母曲的香气成分相比，茶树花大曲中还检测到
了茶树花的一些特征香气成分苯乙酮和α-苯乙醇等，以及咖啡碱。
采用传统酿制大曲酒的技术进行了茶树花大曲酒的酿制，酒样的相关感官及理化
指标结果如下：酒体澄清透亮、无色、无悬浮物、无沉淀，清香纯正，口感柔和协调，
具有类似清香型白酒的风格。成品酒酒精度为33% (v/v)，固形物含量为0.55g/L 。同
时对所得茶树花大曲酒的香气成分进行检测，香气总量为 11020.89mg/L ，其中乙酸
乙酯含量最高，为2624.21mg/L 。由于清香型酒的主体香气成分是乙酸乙酯，因此茶
树花大曲更适制清香型白酒。
关键词：茶树花，大曲，清香型白酒，制作工艺，香气
saccharifying
fermenting
production
traditional and popular distilled alcoholic beverage in China. In the daqu preparation, the
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