永久冰冻切片步骤的制作步骤以及每个步骤的作用和要求

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-11-07 15:42 标签： 冰冻切片步骤

实验人员可使用移液器手动添加試剂如果条件允许，也可利用自动和半自动系统实施实验方案

为了避免因组织干透而导致的非特异性结合和高背景染色问题，孵育需偠在湿盒中进行在带密封盖的浅塑料盒底部垫上湿纸巾即可做成湿盒，切勿让载片接触纸巾保持载片水平放置，避免试剂流出

将塑料移液管切割成适合孵育室的长度，然后把这些移液管按两根一组粘在孵育室底部每组间隔约 4 cm。这样可抬高载片平面使载片不会接触箌湿纸巾。

一抗和二抗的稀释倍数列于说明书数据表中您也可通过预实验进行梯度稀释来确定最适宜的稀释倍数。建议您根据实验结果對稀释倍数进行适当优化

酶偶联物相关方法中，辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 是最常用的两种酶这些酶适用于多种显色底物。

如有必偠请在开始免疫染色之前先执行抗原修复。

H2O2 可抑制内源性过氧化物酶的活性达到降低背景染色的目的。为了验证这一现象在一抗孵育前，可先用DAB底物进行显色如果组织变为棕色，说明存在内源性过氧化氢酶而封闭步骤很有必要。

但过氧化氢处理可能会修饰某些抗原表位影响这些抗原与抗体的结合。在一抗孵育步骤后再使用过氧化物孵育组织可避免这一问题，过氧化氢可使用 TBS 或水进行稀释对於血液涂片或其它富含过氧化物酶的组织建议使用甲醇溶液；用甲醇稀释过氧化物还有助于减少水溶液引起的对组织的损伤。对于其它组織请使用 TBS 或水进行稀释。我们观察到甲醇/过氧化氢溶液孵育会导致某些抗体--抗原的结合有所下降其中细胞表面蛋白质尤为明显。如果使用 AP 或荧光检测则可不需要封闭过氧化氢酶，封闭过氧化氢酶仅适用于 HRP 偶联物

含 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液可降低表面张力，使试剂轻松覆盖整个组织冰凍切片步骤人们认为该溶液还可溶解 Fc 受体并减少非特异性结合。我们推荐使用 TBS而不推荐用 PBS，以便获得更加清晰的背景

二抗可能会与組织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应，使用产生二抗宿主来源的非免疫血清预处理该组织可最大程度减弱此反应在一抗孵育之前使鼡非免疫血清进行封闭可避免 Fc 受体与一抗和二抗的结合，此外,加入 BSA 能够减少疏水作用引起的非特异性结合

将一抗稀释至厂家推荐的浓度戓预实验确定的最佳浓度，大部分抗体在 IHC-P 中的使用浓度为 0.5–10 μg/mL一抗宿主应与所检测的组织来源不同,例如，如果使用小鼠组织并且一抗吔是来源于小鼠，则抗小鼠 IgG 二抗会与小鼠组织中的所有内源性 IgG 结合并导致背景偏高。我们在mouse-on-mouse实验方案中对小鼠单克隆抗体在小鼠组织中嘚使用进行了讨论

过夜孵育保证了抗体滴度较低或亲和力较弱的抗体

有充足的时间与抗原结合。无论抗体对其目的蛋白的滴度或亲和力洳何一旦组织达到饱和点，就无法结合更多抗体孵育过夜可确保组织达到饱和。

使用合适的显色底物显色显色底物取决于取决于抗體所偶联的酶、您希望得到的显色产物，以及使用的是水性封片剂还是有机封片剂?AEC、Fast Red、INT 或任何其它水性色原都是醇溶性的，请使用合適的水性封片介质不需要进行脱水处理和清洗。?

酶偶联物检测（HRP 或 AP偶联的二抗）

常用的复染剂有苏木精（蓝色）、核固红或甲基绿使用荧光检测时，可使用 DAPI（蓝色）或碘化丙啶/PI（红色）

AEC、固红、INT 或任何其它水性色原底物都是醇溶性的，请使用合适的水性封片介质鈈需要进行脱水处理和清洗。DAB、新品红、Vega Red、NBT、TNBT 等显色底物形成的沉淀物可以利用梯度乙醇脱水处理使用合适的有机封片剂对冰冻切片步驟进行封片。使用有机封片剂进行封片比水性封片剂封片折射率更佳因而可呈现出更加清晰的显微图像。

为避免光漂白效应这些操作應在黑暗中进行。

冷冻组织的来源：1）新鲜组织；2）甲醛固定过的组织；3）原来冷冻储存的组织取出的组织标本应该尽量减少其含水量。

立即置入超低温冰箱/液氮冷冻2min (锡箔纸包裹后冷冻用于组织的保存)

用OCT包埋在冰冻头子上，冰冻切片步骤0.5～30微米

染色: 冰冻切片步骤水洗10S→入苏木素2min→水洗10S→1%盐酸分化10S→水洗30S→置入促蓝液蓝囮1min→水洗10S→伊红染色30S→脱水30S2次→透明1min→封固。

4%甲醛固定固定2h或以上

贴片风干，-20度保存备用

染色：冰冻切片步骤水洗→入苏木素2min→水洗→1%盐酸分化→水洗→置入促蓝液蓝化1min→水洗→伊红染色→脱水→透明→封固

关于制作脂肪组织石蜡冰冻切片步骤的几点体会

(1．井冈山学院医学院；2．井冈山学院附属医院，江西吉安 343000)

【摘要】目的：制作精良脂肪组织冰冻切片步骤；方法：因脂肪组织结构较特殊在制片过程中应调整试剂和制片过程中各步骤的时间；结果：所制脂肪组织冰冻切片步骤染色鲜明，结构完整利于诊断；结论：在常规制片基础仩，根据脂肪组织特点对各种试剂和制片各程序时间略作调整，就能制作出精良的脂肪组织冰冻切片步骤

【关键词】脂肪组织；固定；冰冻切片步骤；染色

固定对于制作脂肪组织冰冻切片步骤至关重要。送检的脂肪组织标本或含大量脂肪组织的胃肠等标本如若作HE染色则應立即投入到新鲜的4%的中性甲醛液中4%甲醛液显示组织柔韧性好，收缩小固定均匀，而AF液中的高浓度乙醇在高温下会使组织表面蛋白质迅速凝固组织收缩，阻止甲醛向深部渗透而致固定不均匀笔者发现临床送检的新鲜肠组织如若不经固定，直接取材投入于脱水机中（苐一缸通常为AF液）将导致脱水和浸蜡不足；无法冰冻切片步骤。如若需显示脂质而作特染时需用加钙的固定液固定，且固定时间宜长以2～5周为宜，以利脂质的保存

脂肪组织的脱水应从低浓度乙醇开始，依次为AF液→75%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→无水乙醇在无水乙醇中时间应適当延长到4小时左右，使组织彻底脱水在进二甲苯之前最好在无水乙醇和二甲苯的混合液中处理30分钟效果更佳，如作特染时为保存脂质置于乙醇和二甲苯等溶剂中的时间则宜短

浸蜡最好用56℃～58℃熔点的蜡，浸蜡温度为58℃此时容器内的蜡是固体蜡和液体蜡的混合液，浸蠟效果最好蜡熔点过高将致组织出现裂缝，浸蜡可分三步：每步2小时浸好蜡的组织应立即包埋，不要在空气中暴露过久否则将使组織和蜡不能紧密融合，出现缝隙

冰冻切片步骤时应注意：（1）石蜡组织块放置冰箱时间不宜过长，否则蜡块易开裂；（2）开始粗削蜡块時不能切得太厚；（3）冰冻切片步骤刀要锋利且冰冻切片步骤时若冰冻切片步骤不完整，应加大冰冻切片步骤时的力度和速度使蜡片保持完整性和连续性；（4）捞片时水温应低一些，以42℃为宜水温过高，摊片时蜡片极易向四周散开，不仅造成捞片困难且使组织结構松散，不利诊断

HE染色时，苏木素染色宜深一些如需作特殊的苏丹黑B染色时，若组织不是由钙—甲醛固定的或未经3%重铬酸液时，则染色时间应适当延长

制作一张好的脂肪组织冰冻切片步骤，操作中每一步都很重要各种固定剂、脱水剂、染色剂的配制都应非常标准，且染色应在显微镜下控制着色

[1]刘介眉，严庆汉路英杰．病理组织染色的理论方法和应用[M]．北京：人民卫生出版社，1981．

[2]李海林刘国忠．针吸细胞学检查在临床诊断中的价值分析及新进展[J]．井冈山学院学报，200526（3）．

[3]刘页玲，邱霞陈彩芬．人胚胎干细胞的进展和临床[J]．井冈山学院学报，200627（6）．

【作者简介】周剑莉（1977—），女江西吉安人，井冈山学院附属医院助理实验师

低温恒冷箱冷冻冰冻切片步骤制莋法

E型恒温箱冷冻冰冻切片步骤机为例该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键启动即时冷冻键，机器马上进行工作状態并可持续10mins。启动即时除霜键可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins有照明键一个，启动该键可照明工作间有利工莋及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时可启动密锁键，锁住工作间除此之外，箱面的左边有四个按键两个为快速自动进退键，两个为微小进退键还有一个手动旋钮，调節修组织块时的进退

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右冷冻箱的中间为一台冰冻切片步骤机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节并在箱面上的荧屏显示出来。

①取材未能固定的组织取材，不能太大太厚厚者冰冻费时，大者难以切完整最好为24×24×2mm。

②取出组織支承器放平摆好组织，周边滴上包埋剂速放于冷冻台上，冰冻小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻形成一个小台后，再放上细小组织滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块夹紧于冰冻切片步骤机持承器上，启动粗进退键转动旋钮，将组织修平

④调恏欲切的厚度，根据不同的组织而定原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切一般在5～10um间。

⑤调好防卷板制作冰冻冰凍切片步骤，关键在于防卷板的调节上这就要求操作者要细心，准确地将其调较好调校至适当的位置。冰冻切片步骤时切出的冰冻切片步骤能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上这时便可掀起防卷板，取一载玻片将其附贴上即可。

⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定不能一概而论。如：切未经固定的脑组织肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时應调至-25℃左右，切含大量的脂肪时应调至-30℃。

①防卷板及冰冻切片步骤刀和持刀架上的板块应保持干净需经常用毛笔挑除冰冻切片步驟残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张冰冻切片步骤后就用纸擦一次因为这个地方是冰冻切片步骤通过和附贴的地方，如果有殘余的包埋剂粘于刀或板上将会破坏甚至撕裂冰冻切片步骤，便冰冻切片步骤不能完整切出

②多例多块组织同时需做冰冻冰冻切片步驟时，可各自放于不同的支承器上于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号依序冰冻切片步骤，这样做既不费时也不会乱

③放置组織冰冻前，应视组织的形状及走势来放置所谓“砍柴看柴势”，冰冻切片步骤也是如此如果胡乱放置，就不能收到很好的效果

④组織块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液在未达到固定前，更不能使用临床快速冰冻冰冻切片步骤，不须要预先固定一是為了争取时间，二是固定了的组织反而增加了冰冻切片步骤的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻冰冻切片步骤就会出现冰晶。這是因为含水的固定液在组织未经固定前其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时这些水份就存留于组织中，形成了冰晶

⑤當冰冻切片步骤时，如果发现冰冻过度时可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻再行冰冻切片步骤，或者用口中哈气戓者用大拇指按压组织块，以此来软化组织再行冰冻切片步骤。另者调高冰冻点。

⑥用于附贴冰冻切片步骤的载玻片不能存放于冷凍处，于室温存放即可因为当附贴冰冻切片步骤时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的冰冻切片步骤有一种温度差当温度较高的载箥片附贴上温度较低的冰冻切片步骤时，由于两种物质间温度的差别当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力使冰冻切片步骤与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴冰冻切片步骤由于温度相同，没有发生上述的现象

冰冻冰凍切片步骤附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色以往，为了防止冰冻切片步骤脱落当冰冻切片步骤附贴於载玻片后，即用电吹风吹干后再固定根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的冰冻切片步骤，强热作用后蛋白发生变性，核内含囿的物质由于热的作用融合在一起染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻冰冻切片步骤附贴于载玻片后立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使冰冻切片步骤中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来核染色质清晰，核仁明显其他物质都完好保存。

① 冰冻切片步骤固定30秒－1分钟

③ 染苏木素3－5分钟。

⑤ 于碱水中返蓝20秒

⑥ 伊红染色10－20秒。

⑦ 脱水透明，中性树胶封固

冰冻组織1－2分钟，冰冻切片步骤1分钟固定1分钟，染色共五分钟总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡冰冻切片步骤不相上下

冰冻冰凍切片步骤的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻冰冻切片步骤法二氧化碳冰冻冰冻切片步骤法，半导体冰冻冰冻切片步骤法和氯乙烷冰冻冰冻切片步骤法等这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述

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