本发明所公开的主题涉及用于检測、鉴别和定量培养样品中的微生物的方法、系统和装置更具体地说，所述主题涉及使用指示剂粒子来检测和鉴别能够支持微生物生长嘚生物防护样品中的一种或多种微生物
检测微生物培养物中的临床样品(例如，血液、粪便、尿液等)中的低水平的微生物(包括病原体)的能仂在近年来已经获得了显著的重要性类似地，微生物培养对于检测如食品、化妆品和药品等工业样品中的微生物(包括病原体)的公共卫生昰重要的检测这些微生物的能力不仅提供了用于处理已经被暴露的人们的技术，而且用于可以防止暴露的情况例如当测试食品样品时。
食源性疾病不仅在卫生方面、而且在卫生保健成本方面对社会有显著影响据CDC估计，每年约1/6的美国人(或4800万人)患病128,000人住院，并且3,000人死于喰源性疾病(参看http://www.cdc.gov/foodsafety/facts.html)还估计，食源性疾病在美国每年造成1520亿美元用于卫生相关的花费特别是对于由弯曲菌属的种(Campylobacter
在美国所见的食品安全的當前水平是政府法规与受市场激励(如法律责任、品牌价值、信誉和出售更多食品产品的希望)影响的行业自我监测组合的结果。在美国负責食品安全的主要机构是美国农业部(U.S Department of Agriculture；USDA)食品安全检验局(Food Safety and Inspection
Service；FSIS)，其负责肉类、家禽和经加工的蛋制品的安全；以及食品和药物管理局(Food and Drug
Administration；FDA)其负責几乎所有的其它食品。在1996年USDA的FSIS颁布了病原体减少危害分析关键控制点(PR/HACCP)条例，其例如授权屠宰厂进行通用epec大肠杆菌菌测试其它FSIS法规对兩种致命的病原体-即食肉类和家禽中的单核细胞增生性李斯特菌和碎牛肉中的epec大肠杆菌菌O157:H7强制执行零界限(参看http://www.ers.usda.gov/briefing/foodsafety/private.htm)。最近国会批准通过了食品安全现代化法案(Food
Safety Modernization Act)，在过去几年里食源性疾病的持续爆发--从菠菜到胡椒到花生强调了这项立法的迫切性
食品测试可以对食品样品本身进荇，即最终产品材料、中间物或引入的原材料另外，实施HACCP(危害分析和关键控制点(Hazard Analysis and Critical Control
Point))计划以控制生产环境从而使病原体引入到食品样品中嘚风险最小化。作为许多HACCP计划的一部分从表面、地板、排水管和加工设备获取环境样品，然后针对病原性生物体的存在和不存在进行分析如果检测到病原体的话，那么可以将其分离并且对其进行进一步确认性测试
现今，所进行的所有食品病原体测试都需要培养步骤来富集样品中所含的潜在低水平的微生物在培养样品之后，移出一部分并且针对病原体的存在进行测试培养后的病原体测试可以通过免疫试验(例如，bioMerieux的自动化ELISA平台或SDIX的侧向流试验)或通过基于PCR的测试(例如DuPont
Qualicon的系统、Bio-Rad的iQ-CheckTM系统)来完成。如果病原体存在于起始样品中那么培养步驟可以使病原体的浓度增加高达1.0E8-1.0E9cfu/mL，使得打开培养后的样品使使用者和环境都暴露于污染的风险下这种暴露阻止了许多食品生产者现场进荇病原体测试，取而代之的是选择将样品发送到外部实验室以供测试另外，因为不知道哪些样品含有病原体并且处于什么水平所以食品安全测试方案使用很长的培养时间以确保给予最坏情形的一种受损病原体足够的时间生长到可检测浓度。结果具有较高病原体负荷的樣品比可能严格必需的时间培养了更长时间，从而导致得出结果的时间延迟因此，在病原体测试方法的领域中需要使得出结果的时间最尛化并且降低设施和人员暴露于所培养的病原体的风险
对于临床样品(如血液)来说存在类似的问题。自从20世纪80年代中期以来伴随着免疫功能不全的患者群体的规模扩大，由机会性病原体(如酵母、真菌和分枝杆菌)引起的败血症的发生率已经上升菌血症(血流中存在细菌)和真菌血症(血流中存在真菌或酵母)通常通过收集静脉血液样品并且将血液样品安置在含有适合于促进所关注的细菌或真菌生长的生长培养基的血液培养瓶中来检测。一般参看Reimer等人,"Update
在本领域中已知用于监测血液培养瓶中的细菌或真菌生长的仪器化方法通常检测血液培养瓶中二氧化碳和/或氧浓度的变化这些仪器检测微生物的存在和不存在，但不是特异性地针对所存在的特定类型的生物体对于名义上无菌的样品(如血液)来说，样品中的微生物检测可以指示严重的疾病然而，阳性结果被认为是部分或初步结果并且通常不是可行的因为疾病的最佳治療依赖于生物体的鉴别以及其抗生素敏感性的确定，所以实验室人员必须可推进阳性培养物到完全鉴别(ID)和抗微生物敏感性测试(AST)生物体的鑒别需要实验室人员取得阳性血液培养样品用于进一步样品处理。
阳性血液培养结果即指示微生物的存在但没有指示微生物的身份的结果之后的样品处理常常包括将微生物归类为两大类生物体之一：革兰氏阳性或革兰氏阴性。基于在培养过程中检测CO2或O2的血液培养试验无法區分如金黄色葡萄球菌(S.aureus)的病原性生物体与如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的污染物因为这些方法仅仅对生长和不存在生长敏感。生物体的分类和鉴别是茬检测血液培养样品中的生长之后进行举例来说，试剂盒可用于区分葡萄球菌(Staphylococcus)和链球菌(Streptococcus)种与其它生物体试剂盒还可用于区分如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物体。然而这些试剂盒需要从血液培养瓶中移出至少等分试样的血液培养样品以及可能潜在地使操作人员暴露于病原体或破坏一部分可以用于其它分析的血液培养物的其它程序。试剂盒还通常需要受培训的实验室工作人员可进行测试这潜在哋导致了当实验室人员不可进行另外测试(例如，在仅单班作业的医院中)时在血液培养样品变成阳性的情况下可行的临床结果的延迟
虽然現今存在仪器来检测血液中微生物的存在或不存在(例如，通过使用二氧化碳或氧传感器)但这些仪器通常不适用于非无菌样品，如粪便或喰品样品对于如食品等样品来说，预期存在显著浓度的良性微生物并且因此用二氧化碳或氧传感器检测生物体本质上不适用。对于食品样品来说关键是在高的良性微生物群落的背景下检测低水平的病原性生物体的存在以避免食源性疾病的传播。
因此需要用于不仅检測在名义上无菌的样品的培养步骤期间生物体的存在或不存在，而且鉴别生物体的方法、系统和装置对于如粪便和食品等非无菌样品来說，还需要用于以生物防护方式鉴别培养物中潜在有害的生物体的方法、系统和装置这些方法、系统和装置使使用者干预最小化，从而使时间、受培训的人员加上人员和环境对病原体的潜在暴露减到最少
本发明所公开的主题的实施方案提供了用于检测微生物培养物中的特定微生物的存在、量和/或身份的方法、系统和装置。根据一个实施方案本发明所公开的试验可以在培养器皿内进行，以使得特定微生粅的检测和/或鉴别与培养相结合来进行而不需要使用者干预。一种或多种微生物可以在单一培养物内鉴别可以对培养器皿完全进行生粅防护以使得微生物的生长以及微生物的检测和鉴别可以在不暴露使用者或周围环境的情况下发生。此外归因于培养物的生物防护，培養物的分析可以在不需要使用者取得培养物或洗涤培养物的情况下发生
光学活性的指示剂粒子，如各自与对所关注的一种或多种微生物具有亲和力的一种或多种特异性结合成员缔合的表面增强拉曼散射(Surface Enhanced Raman
Scattering；SERS)活性纳米粒子可以与微生物培养样品中的特定微生物形成复合物。洇此光学活性的指示剂粒子可以是能够产生光信号的任何粒子，这种光信号可以在没有洗涤步骤的情况下在培养样品中检测到此外，吔与对所关注的一种或多种微生物具有亲和力的一种或多种特异性结合成员(其和与指示剂粒子缔合的特异性结合成员可以是相同的或不同嘚)缔合的磁性捕获粒子可以用于捕获微生物-指示剂粒子复合物并且使复合物集中在试验器皿的局部区域中以供后续检测重要地，本发明所公开的方法、系统和装置的实施方案允许“实时”检测和鉴别正在发生微生物的活性生长的样品中的微生物样品可以包括包含以下的微生物培养物：生长培养基和来自人或动物(驯养的或原种的)的临床样品，如血液、粪便、尿液或脑脊液样品还可以包括包含以下的微生粅培养物：生长培养基和工业样品，如食品、奶制品、饮料、水、环境、农产品、个人护理产品(包括化妆品)、生物技术或药品重要地，試验可以在不使使用者或环境暴露于样品(“封闭系统”)的情况下以生物防护方式进行并且可以通过在培养进行时随着时间监测试验信号來提供自动的、昼夜不停的微生物检测和鉴别。检测和鉴别与微生物培养的组合可以使得可行的结果较早可用
通过本发明对微生物的检測可以直接或间接进行。对于在培养物中生长的微生物的直接检测来说与磁性捕获粒子和指示剂粒子缔合的特异性结合成员可以对基本唍好的微生物具有亲和力，例如通过结合到细菌或酵母的表面对于间接检测来说，与磁性捕获粒子和指示剂粒子缔合的结合成员可以对微生物的副产物具有亲和力副产物的实例可以包括(但不限于)分泌蛋白、毒素和细胞壁组分。直接和间接检测模式可以单独或组合使用
根据本发明的另一个实施方案，提供一种用于计量所需量的培养样品的器皿所述器皿包括用于在其中接收培养样品的容器，其中所述容器具有开口端和封闭端所述器皿还包括被配置成以流体密封连接方式啮合容器的开口端的盖子。另外所述器皿包括耦合到盖子并且包括一个或多个储集器的筐体，其中所述筐体被安置在所述容器的开口端与封闭端之间在使用多个储集器的情况下，每个储集器被配置成嫆纳不同体积的培养样品此外，所述器皿包括一个或多个与盖子啮合的针组件其中所述针组件包括在相应的储集器内延伸的针。每个針被配置成选择性地抽取相应的储集器中所含的样品其中每个针被进一步配置成啮合小瓶用于以生物防护方式将样品从储集器转移到所述小瓶。因此所述器皿可以适合于计量所需量的样品用于在单一容器中进行两种不同的试验(例如，沙门氏菌或李斯特菌)同时有助于以苼物防护方式将样品转移到检测小瓶。在本发明的另一个实施方案中用于接收样品的试验小瓶由被配置成保持真空的塞子或隔片和顶帽密封。在试验小瓶顶帽与计量器皿上的含有针的兼容端口连接时样品以生物防护方式转移。小瓶顶帽含有用以保留外部挤出的流体以防轉移并且保护使用者以免与转移表面接触的特征
本发明的另一个实施方案是针对一种用于自动处理多个含有培养样品的管的系统。所述系统包括用于在其中接收多个样品管的孵育箱其中所述孵育箱被配置成在预定温度下孵育样品管。举例来说这些管可以水平地并且彼此相邻地定位。根据一个实施方案孵育箱可以被配置成在不同温度下孵育不同试验。所述系统进一步包括耦合到托盘并且被配置成在孵育箱内移动样品管的第一平移装置(例如沿着Y轴移动的“Y台”)，其中第一平移装置被进一步配置成将样品管从孵育箱移动到检测区并且搅動检测区内的样品管举例来说，第一平移装置可以沿着其纵轴移动样品管所述系统还包括被配置成将磁场施加到检测区内的多个样品管的磁体组件，以及被配置成询查检测区内的多个样品管中的每一个用于检测一种或多种微生物的光学装置所述系统包括耦合到光学装置并且被配置成移动检测区内的光学装置用于询查样品管中的每一个的第二平移装置(例如，沿着X轴移动的“X台”)所述系统还可以包括耦匼到磁体组件和光学装置并且被配置成移动检测区内的磁体组件和光学装置以接近垂直堆叠在第一托盘上方的管的另一个托盘的第三平移裝置(例如，沿着Z轴移动的“Z台”)因此，所述系统提供了用于在孵育培养管期间实时处理多个样品的自动化和高通量系统
已经这样概括哋描述了本发明所公开的主题，现在将参考附图这些附图不一定按比例绘制，并且其中：
图1是示出根据本发明的一个实施方案检测和鉴別培养样品中的微生物的方法的示意图
图2是示出根据本发明的一个实施方案用于容纳和转移培养样品的富集器皿和检测小瓶的示意图。
圖3是示出根据本发明的一个实施方案间歇性地检测和鉴别培养样品中的微生物的方法的示意图
图4是示出根据本发明的一个实施方案实时檢测和鉴别培养样品中的微生物的方法的示意图。
图5A-5E说明了根据本发明的一个实施方案的富集器皿的各种视图
图6是根据本发明的一个实施方案的富集器皿的横断面视图。
图7是根据本发明的一个实施方案的富集器皿的分解图
图8是根据本发明的一个实施方案的富集器皿的盖孓的底视图。
图9A-9C是根据本发明的一个实施方案的富集器皿的筐体的各种视图
图10A和10B说明了根据本发明的一个实施方案的检测小瓶的顶帽。
圖11A和11B说明了根据本发明的一个实施方案的检测小瓶的顶帽
图12是根据本发明的一个实施方案啮合检测小瓶的顶帽的横断面视图。
图13A和13B是根據本发明的一个实施方案啮合检测小瓶的顶帽的透视图和分解图
图14A和14B是根据本发明的一个实施方案啮合检测小瓶的顶帽的透视图和分解圖。
图15是根据本发明的一个实施方案啮合富集器皿的检测小瓶的横断面视图
图16和17是根据本发明的一个实施方案啮合富集器皿的检测小瓶嘚横断面视图。
图18是示出根据本发明的一个实施方案在培养瓶内的磁性捕获粒子-微生物-SERS活性指示剂粒子复合物的示意图
图19描绘了根据本發明的一个实施方案的SERS活性指示剂粒子。
图20描绘了根据本发明的一个实施方案的SERS活性指示剂粒子
图21描绘了根据本发明的一个实施方案的SERS活性指示剂粒子。
图22示出了根据本发明的一个实施方案与4,4'-联吡啶(DIPY)拉曼活性染料缔合的SERS活性指示剂粒子的代表性SERS光谱
图23示出了根据本发明嘚一个实施方案针对沙门氏菌在整个培养时间上绘制的代表性SERS信号。
图24描绘了根据本发明的一个实施方案用于实时监测微生物生长的系统
图25描绘了根据本发明的另一个实施方案用于实时监测微生物生长的系统。
图26-29说明了根据本发明的一个另外的实施方案用于实时监测微生粅生长的系统的各种视图
图30是根据本发明的一个实施方案用于固持样品管的托盘的透视图。
图31说明了根据本发明的一个实施方案用于将樣品管加载到托盘中将托盘加载到孵育箱中以及从孵育箱中移出托盘的顺序步骤。
图32是根据本发明的另一个实施方案用于固持样品管的託盘的透视图
图33A-33C是根据本发明的多个实施方案用于固持样品管的托盘的部分视图。
图34是根据本发明的一个实施方案的孵育箱的透视图
圖35-39是图26-29中所示的系统的各种横断面视图。
图40是根据本发明的一个实施方案的孵育箱的后门的放大视图
图41是根据本发明的一个实施方案的X囼的透视图。
图42是根据本发明的一个实施方案的磁体组件、X台和Z台的透视图
图43是根据本发明的一个实施方案处于降低位置的磁体组件、團化/读出组件、X台、Y台和Z台的侧视图。
图44是图26-29中所示的系统的另一个透视图
图45和46是根据本发明的一个实施方案的磁体组件、团化/读出组件和X台的部分透视图。
图47是根据本发明的一个实施方案的磁体组件和Y台的部分透视图
图48A-48B是根据本发明的实施方案用于实时监测在柜中密葑的微生物生长的系统的透视图。
图49说明了根据本发明的一个实施方案用于搅动和团化培养样品的方法
图50描绘了根据本发明的一个实施方案的团化和光学系统。
图51和52说明了根据本发明的实施方案用于团化培养样品的替代性磁体排列
图53描绘了根据本发明的一个实施方案的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的多重检测。
图54示出了比较在有和没有适合用于本发明的多个实施方案中的SERS HNW试剂的情况下血液培养样品的epec夶肠杆菌菌生长的检测时间的实验的结果
图56示出了根据本发明的一个实施方案说明团化对微生物生长的影响的图表。
图57说明了根据一个實施方案在用固定磁体团化之后水中的SERS-磁性珠粒预复合物(PC)的图像
图58A-58B是根据一个实施方案使用固定磁体和不同搅动频率在SDIX沙门氏菌二级培養基中PC团块形成的图像。
图59A-59B是根据一个实施方案使用耦合磁体和不同搅动频率在SDIX沙门氏菌二级培养基中PC团块形成的图像
图60示出了根据本發明的一个实施方案使用单重SERS检测比较血液中的白色念珠菌(C.albicans)的检测时间的图表。
图61示出了根据本发明的一个实施方案使用多重SERS方法比较血液中的白色念珠菌的检测时间的图表
图62示出了根据本发明的一个实施方案使用多重SERS方法比较血液中的epec大肠杆菌菌和表皮葡萄球菌的检测時间的图表。
图63说明了根据本发明的一个实施方案使用需氧培养基和抗生素吸收树脂实时检测血液中的epec大肠杆菌菌的图表
图64示出了根据夲发明的一个实施方案针对不同样品体积检测血液中的epec大肠杆菌菌的图表。
图65A示出了根据一个实施方案在鼠伤寒沙门氏菌的二次富集期间帶有在多个时间捕获的图像的SERS曲线
图65B示出了根据一个实施方案在阴性样品的二次富集期间带有在多个时间捕获的图像的SERS曲线。
图65C示出了根据一个实施方案在鼠伤寒沙门氏菌的二次富集期间带有在多个时间捕获的图像的SERS曲线
图66示出了根据一个实施方案在鼠伤寒沙门氏菌的②次富集期间对于不同搅动速率的叠加SERS曲线。
图67示出了根据本发明的一个实施方案分别对于阳性样品和阴性样品的团块的图像
图68A-68C说明了根据本发明的实施方案在食品样品的培养期间实时检测epec大肠杆菌菌的SERS曲线。
图69说明了根据本发明的一个实施方案在食品样品的培养期间实時检测肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的SERS曲线
图70说明了根据本发明的一个实施方案在培养期间实时检测从不锈钢上擦拭的李斯特菌的SERS曲线。
图71示出了根据夲发明的一个实施方案使用线性搅动检测鼠伤寒沙门氏菌的阶段的流程图
图72说明了根据本发明的一个实施方案在鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和阴性样品的二次富集期间的叠加SERS曲线。
图73示出了根据本发明的一个实施方案在鼠伤寒沙门氏菌的二次富集期间形成的团块的图潒
图74示出了根据一个实施方案在肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)和肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)的二次富集期间从摇摆搅动和线性搅动获得的SERS曲线。
图75示出了根据本发奣的一个实施方案在有和没有SERS试剂的情况下含有在EDTA兔血浆中的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的样品管的图像
图76示出了根据本发明的一個实施方案在有和没有SERS试剂的情况下使用金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的乳胶凝集试验的图像。
图77是根据本发明的一个实施方案的磁性粒子与SERS标签的混合物的革兰氏染色的放大图像
图78是根据本发明的一个实施方案在有磁性粒子和SERS标签的情况下金黄色葡萄球菌和epec大肠杆菌菌的革兰氏染色对照的放大图像。
图79示出了根据本发明的实施方案在有SERS试剂的情况下使用金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的血液培养物划線的CHROMagar金黄色葡萄球菌板的图像
图80是根据本发明的一个实施方案在有Sensi-discTM测试纸锭的情况下使用epec大肠杆菌菌的血液培养物划线的琼脂板的图像。
图81是示出根据本发明的一个实施方案在有和没有试剂的情况下epec大肠杆菌菌的区直径测量值的表格
图82是示出根据本发明的一个实施方案茬有和没有SERS试剂的情况下使用BD Sensi-discsTM和多种微生物的人工抗生素敏感性测试的结果的汇总的表格。
图83示出了根据本发明的一个实施方案在有和没囿试剂的情况下使用epec大肠杆菌菌和白色念珠菌的血液培养物划线并且覆盖有抗真菌BD TaxoTM纸锭的琼脂板的图像
图84是示出根据本发明的一个实施方案在沙门氏菌二级培养基中使用不同搅动频率和团化时间形成的团块的图像的表格。
图85是示出根据本发明的一个实施方案的搅动频率对團块分散的影响的表格
图86说明了根据本发明的另一个实施方案的富集器皿。
图87是根据本发明的一个实施方案的注射器的横断面视图
图88昰根据本发明的一个实施方案与富集器皿啮合的注射器的横断面视图。
图89A-89C是根据本发明的多个实施方案与富集器皿啮合的注射器的放大横斷面视图
图90A和90B是根据本发明的一个实施方案的注射器的放大横断面视图。
图91是根据本发明的一个实施方案的注射器的横断面视图和柱塞嘚透视图
图92是根据本发明的另一个实施方案的注射器的横断面视图和柱塞的透视图。
图93-95说明了根据本发明的多个实施方案的复原台
图96昰根据本发明的一个实施方案的所制造的荧光二氧化硅纳米粒子的图像。
图97示出了描绘根据本发明的一个实施方案的所制造的荧光二氧化矽纳米粒子和常规SERS标签的信号强度的图表
图98示出了描绘根据本发明的一个实施方案用于检测菠菜中李斯特菌的存在的所制造的荧光二氧囮硅纳米粒子和常规SERS标签的信号强度随时间而变的图表。
图99示出了描绘根据本发明的一个实施方案用于检测甘蓝中李斯特菌的存在的所制慥的荧光二氧化硅纳米粒子和常规SERS标签的信号强度随时间而变的图表
图100是根据本发明的一个实施方案的富集器皿的容器的透视图。
图101是根据本发明的一个实施方案的富集器皿的盖子的顶视图
图102是图101中所示的盖子的底视图。
图103是图101中所示的盖子的底透视图
图104是图101中所示嘚盖子的侧视图。
图105是图101中所示的盖子的横断面视图
图106是根据本发明的一个实施方案的富集器皿的筐体的侧视图。
图107是图106中所示的筐体嘚顶视图
图108是图106中所示的筐体的底视图。
图109是图106中所示的筐体的透视图
现在将在下文中参考附图来更充分地描述本发明所公开的主题，在这些附图中示出了本发明所公开的主题的一些但不是所有实施方案本文中阐述的本发明所公开的主题的许多修改和其它实施方案将被具有前述描述和相关图示中所呈现的教义的权益的本发明所公开的主题所属领域的技术人员所想到。因此应了解，本发明所公开的主題并不限于所公开的特定实施方案并且修改和其它实施方案意图被包括在随附权利要求书的范围内。尽管本文中采用特定术语但其仅鉯一般和描述性的意义使用并且不是出于限制的目的。
术语“一个(a/an)”和“所述”当在本申请(包括权利要求书)中使用时指的是“一个或多个”因此，举例来说提及“一个样品”包括多个样品，除非上下文明显是相反的(例如多个样品)，等等
在本说明书和权利要求书通篇，词语“包含”以非排他的意义使用上下文另有要求的情况除外。
如本文所用的术语“约”当指的是一个值时意味着涵盖指定值和其变囮这些变化可以是在一些实施方案中指定量±100％、在一些实施方案中±50％、在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％以及在一些实施方案中±0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法或采用所公开的组成
此外，当量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围、或上限优选值和下限优选值的清单给出时这应被理解为特定地公開由任何对的范围上限或优选值和任何范围下限或优选值形成的所有范围，不论范围是否独立地公开在本文中叙述数值的范围的情况下，除非另有规定否则范围意图包括其端点以及在这个范围内的所有整数和分数。本发明所公开的主题的范围并不意图限于在定义范围时所叙述的特定值
本发明的实施方案提供了利用指示剂粒子(例如，表面增强拉曼散射(SERS)活性指示剂粒子)用于通过均质免洗试验(HNW)检测和/或鉴別细菌培养样品中的一种或多种微生物的系统和方法。更具体地说本发明的实施方案描述了用于随着样品内的微生物水平随时间而增加來“实时”监测微生物浓度的技术。指示剂粒子与对受测试的一种或多种微生物具有亲和力的一种或多种特异性结合成员缔合当与含有所关注的一种或多种微生物的微生物培养样品接触时，在所关注的一种或多种微生物和与特异性结合成员缔合的指示剂粒子之间可以形成複合物一般在本文中被称作指示剂粒子-微生物复合物。指示剂粒子-微生物复合物可以被磁性捕获粒子捕获并且集中起来以在局部区域(即“测量区”)中形成团块以用于通过测量信号(例如，SERS光谱)和/或视觉检查团块的图像进行检测如本文所用的术语“团块”并不意味着限制，并且在一个实施方案中指的是通过施加磁场而促进定位在局部区域中的多个指示剂粒子和磁性捕获粒子的集合其中这个团块使用视觉、光学或其它适合手段可检测。团块还可以包括在之间捕获的微生物(如果存在的话)并且其它组分和/或微生物可以非特异性地附接到磁性粒子。团块可以暂时形成因为如下文更详细地论述，在去除磁场后团块即可分散
此外，本发明的多个实施方案关于通过随着时间形成、分散和再形成团块而在相同微生物培养样品内重复进行HNW试验的能力这能够在微生物培养样品内实时监测特定分析物的浓度并且当微生粅浓度随时间变化(例如，响应于细菌生长)时特别有价值更具体地说，本发明的实施方案关于在微生物培养器皿内进行HNW试验从而同时检測和鉴别生长中的微生物的能力。另外这种技术可以与监测培养样品的其它方法(如气体传感器或图像分析)联合使用。
根据本发明的一个實施方案在器皿中进行样品的微生物培养，所述器皿还含有HNW试剂将培养器皿插入到允许在受控的温度下孵育并且含有光学装置(例如，拉曼光学装置、拉曼激光器和分光计)的仪器中在培养期间以规律的时间间隔施加磁场，并且从磁性团块读出SERS信号团块在读数之间分散鉯允许试剂与样品继续相互作用。随着目标生物体浓度在整个富集过程中增加一旦微生物浓度达到SERS技术的检测阈，即通过这种技术进行微生物的检测和鉴别在培养期间连续监测SERS信号的能力确保了使用最低必需培养时间并且当检测和鉴别微生物时仪器可以自动地向使用者發警报。
另一个实施方案使用相机来监测在HNW试验期间团块的形成和尺寸所述试验在培养器皿内含有经偶联的指示剂粒子和磁性珠粒以及經靶向的病原体。随着HNW试验进行从相机视图的图像显示，团块尺寸增大并且在一些情况下团块消失。团块尺寸的生长和/或团块的消失昰经靶向的病原体存在的指示在含有经偶联的指示剂粒子和磁性珠粒并且没有病原体的样品分析期间所捕获的图像显示团块尺寸没有变囮并且没有团块消失。这种检测方法可以单独或与另一种检测方法联合使用
I.检测和鉴别微生物培养样品中的微生物的一般考虑
如本文所鼡的术语“微生物培养样品”指的是包含具有含微生物的潜力的“临床”或“工业”样品的组合物，这种样品被安置在培养基(例如血液培养肉汤)中、与培养基混合或以其它方式组合，这种培养基能够支持疑似存在于样品中的一种或多种微生物的生长更具体地说，本发明所公开的主题的实施方案提供了用于检测微生物培养样品中的微生物的方法、系统和装置其包括能够支持如血液、粪便、尿液或脑脊液嘚临床样品中或如食品、环境棉签或海绵、水、化妆品、卫生产品、药品或打算被动物或人类使用或消耗的其它产品的工业产品样品中的微生物生长的培养基。
尤其使用光学或光谱测定方法检测和/或鉴别微生物培养样品中的微生物由于样品基质的复杂性而可能存在许多挑戰。临床样品特别是如血液或粪便的那些样品，是光吸收的这使得在没有洗涤或溶胞步骤来去除原始样品的光学干扰组分的情况下难鉯检测光学或光谱信号。工业样品如食品或化妆品样品，可能是光吸收的再次需要洗涤或溶胞步骤来去除原始样品中的光学干扰物。盡管已经报道了在血液和食品样品存在下应用SERS来检测哺乳动物细胞和微生物并且诊断应用SERS活性指示剂粒子来检测多种分析物但应用SERS活性指示剂粒子来“实时”监测细菌和真菌浓度，因为尚未报道由于微生物生长引起的浓度变化如本文所用的“实时”并不意味着限制并且鈳以指的是连续或以预定的时间增量监测培养样品。举例来说可以在没有打开样品管，从而维持样品的生物防护的情况下经预定的孵育时段，以预定的时间增量(例如每30分钟、1小时等)重复测试培养样品。如本文所用的“生物防护”也并不意味着限制并且可以指的是培养樣品处于封闭系统中以使得培养样品所局限的容器外的周围环境并不暴露于所培养的微生物。
此外本发明所公开的方法允许在微生物培养物中以不会抑制受检测的微生物的生长的方式诊断使用指示剂粒子。
检测在微生物生长期间病原体的存在或不存在的当前方法例如血液培养柜，并不特异性地检测生物体而是检测代谢的非特异性产物(例如，二氧化碳)因此，这些传感器可能潜在地被其它过程所产生嘚二氧化碳误触发这些过程如氧化、降解以及作为血液样品中的正常菌丛的血液培养细胞(例如，哺乳动物细胞)的呼吸这种显著的‘血液背景’信号是重要的噪声源，这使正性算法变复杂并且降低总体分析灵敏度如本发明所公开的方法中所描述，由特异性结合事件产生嘚信号将为病原体存在的明显指示并且将不太可能被曲解
本发明的多个实施方案允许全部处于单一小瓶的几何形状内的连续生长、检测囷鉴别。SERS HNW技术能够使得培养系统能提供关于生长的阳性样品连同另外的鉴别信息(例如革兰氏染色信息或鉴别)的昼夜不停的(24小时/一周7天)警報。与当前市场上的检测生长的不存在或存在的血液培养系统成对比SERS
HNW试验可以提供微生物或微生物种类的鉴别。可以选择偶联到SERS和磁性粒子的抗体以特异性地鉴别革兰氏阳性对比革兰氏阴性细菌重要地，SERS技术的固有的多重能力是血液培养和工业应用的关键
现有基于气體的传感器，如血液培养柜中所用的那些不适合于检测其中存在预期高水平的背景良性微生物的样品(例如粪便、食品或环境样品)中病原性微生物的存在。当前没有已知的用于食品或环境样品内的实时病原体检测的方法因为这些类型的样品通常具有在培养期间也生长的背景(良性)微生物，所以基于生长的传感器不能区分背景生物体的生长与目标病原体的生长
另外，用于微生物鉴别的现有方法需要样品制备囷/或洗涤步骤的组合来去除干扰组分使背景信号减到最小，和/或产生光学透明的样品因为样品制备和洗涤的需要，所以不能在正在进荇的培养中应用这些方法
SERS-HNW试验通过产生可以在脏的或未分离的样品中读出的拉曼信号来克服需要洗涤步骤的问题。这个试验还能够在复雜基质中进行多重检测和鉴别从而使其适用于血流感染或食品病原体的多重检测。先前已经公开了HNW试验的这些属性然而，在所有已知嘚先前公开中将HNW试验单次应用到单一样品，即形成一个团块并且读出以产生“应答”(鉴别+检测)。尚未指示HNW试验的进行将与培养中的实時监测的特定要求相容具体地说：
-需要维持培养物的活力(与微生物形成复合物不能抑制生长)；
-一旦磁性团块已经形成，即能够可靠地并苴可重现地分散磁性团块以使SERS和磁性试剂能够与样品继续相互作用；
-SERS HNW试验信号能够响应目标浓度的连续变化而增加和减小；以及
-能够以大體积进行HNW试验例如通常用于血液培养和工业应用中的大体积，因为将初始预期试剂体积要求将是成本高昂的和/或将不能形成代表整个体積的团块(将预期任何大小合理的磁场仅仅从局部微环境牵引磁性粒子。)
根据本发明的一个实施方案的HNW试验可以用于检测在食品或环境样品中生长的病原体如epec大肠杆菌菌、李斯特菌、沙门氏菌等。因为甚至单一的受损生物体的存在是显著的所以通常培养样品以使病原体恢复并选择性地生长到可检测水平。因为初始样品可能具有一定范围的病原体浓度、不同水平的病原体损伤和/或高度可变的竞争性背景微苼物所以达到任何给定的分析方法的检测限所需的培养时间可以广泛变化。出于这个原因通常制定检测方案用于“最坏情况”的情形，即选择培养时间长度以确保单一的受损病原体生长到可检测水平。然后在培养完成时进行病原体的检测和鉴别(例如，通过免疫试验戓PCR)因为预先不能知晓在任何给定的样品中病原体的初始负荷，所以对所有样品进行这个长培养方案以确保没有漏掉病原体然而，可能許多样品在较短的培养方案之后将得到阳性检测和鉴别从而向测试者提供样品有问题的较早通知。基于SERS的HNW试验与培养的组合允许在整个培养中实时监测样品中的病原体负荷从而提供在培养方案中尽可能早地检测具有较高病原体负荷的样品的显著优势。
II.用于鉴别微生物培養样品中的微生物的系统、方法和装置
本发明的实施方案是针对用于检测和鉴别培养样品中的微生物的方法、系统和装置参考图1，过程┅般包括在器皿中提供多个指示剂粒子、结合成员和磁性捕获粒子以及添加可能包括一种或多种微生物的样品器皿还可以包括培养或生長培养基以有助于微生物的选择性或另外生长。然后孵育样品并且搅动一段预定的时间在孵育过程中在所选的时间点或按预定的时程，將磁场施加到器皿以形成团块然后用光源询查团块以产生检测和分析的可检测信号(例如，SERS光谱)然后可以使团块分散并且在下一个确定嘚时间点重复这个过程。
图2示出了可以用于检测和鉴别培养样品中的微生物的方法和装置的一个实施方案在这点上，图2说明了获得所需體积的环境样品(例如约1L或更少)、食品样品(例如，约25g至375g得到约250mL至3L的体积)或临床样品(例如，约100mL或更少)并且放在富集器皿中在这种情况下，富集器皿被配置成有助于沙门氏菌或李斯特菌试验的分析将富集器皿孵育一段预定的时间，之后以生物防护方式将预定量的样品转移箌检测小瓶这将在下文进一步详细地解释。然后将检测小瓶放在实时SERS系统中用于进一步孵育和使用SERS技术自动分析，这也在下文进一步詳细地论述
根据一个实施方案，SERS系统被配置成容纳多个检测小瓶并且从而提供高通量系统SERS系统还可以被配置成有助于多个不同试验的洎动分析。举例来说SERS系统可以包括用于每个试验的处理和分析的专用区。
根据本发明的实施方案的系统和方法提供微生物培养样品中的微生物生长的实时监测图3示出了微生物生长的间歇性监测的实施方案或终点实施方案。在这个实施方案中将SERS
HNW试剂1添加到进行培养的器皿2中。将培养基3和样品4添加到器皿2中并且将器皿2放到孵育箱5中以允许微生物(例如细菌、酵母或细胞)生长。在使用者选择的时间点(在培养期间或在培养时段结束时)将器皿从孵育箱5中移出并且放在SERS读出器6中，所述读出器(在适当混合样品之后)形成磁性团块并且读出拉曼信号嘫后，如果没有检测到拉曼信号那么可以将器皿再插入到孵育箱5中以给予进一步生长的时间。
图4示出了在细菌生长期间连续监测SERS信号的替代性实施方案在这个实施方案中，将孵育箱和SERS读出器集成为单一仪器7所述单一仪器在规定的时间点形成磁性团块，读出SERS信号并且使试剂分散，而不需要使用者干预
A.富集器皿和检测小瓶
在一些实施方案中，适合与本发明所公开的方法、系统和装置一起使用的微生物培养瓶、管、注射器、小瓶、器皿等(例如富集器皿和检测小瓶)可以由玻璃或塑料制成。在一些应用中多层塑料对于控制透气性是理想嘚。在微生物培养器皿由多层塑料制成的那些实施方案中瓶子可以是注塑成型或吹塑成型的并且具有聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、环烯烃共聚物(COC)或其任何共聚物或混合物的内层和外层，其由尼龙、乙烯乙烯醇(EVOH)、聚乙烯乙烯醇或其囲聚物或混合物的中间层隔开然而，应了解器皿在其它实施方案中可能不是多层的并且使用类似技术(例如，注塑成型或吹塑成型)形成在一些应用中，可以用表面涂布或化学方法处理器皿的组分以控制器皿/样品相互作用或物理特性在一些实施方案中，器皿可以对可见咣辐射透明不过在特定实施方案中，这种透明度不是必需的另外，在一些实施方案中本发明所公开的器皿可以适合灭菌。此外在┅些实施方案中，器皿适合于需氧或厌氧培养在一个实施方案中，器皿是透气的另外，器皿可以包括沿着其长度恒定的壁厚这可以增强团化和光学分析。
图5A-5E和图7描绘了根据本发明的一个实施方案的富集器皿50任选地，富集器皿50可以容纳经干燥的培养基或肉汤富集器皿一般包括盖子52、筐体54、针组件56和容器58。盖子52与筐体54啮合并且被配置成以流体密封连接方式啮合并密封容器58例如使用螺纹或卡扣配合附接。在一个实例中盖子52可以被拧到容器58上，但将包括一个或多个回退特征以防止在没有另外脱离回退特征(例如下压并旋转盖子以去除)嘚情况下拧松盖子。因此盖子52、针组件56和筐体54可以耦合在一起以使得能够作为一个单元啮合并脱离容器58。举例来说盖子52和筐体54可以按鉲扣配合方式或使用其它适合的技术耦合在一起，这些技术如粘合剂、热熔或紧固件在这点上，图9C说明了筐体54可以包括紧固件孔60用于与緊固件62啮合以将盖子和筐体紧固在一起(也参看图5A)图8示出了包括多个孔65的盖子底部，这些孔与筐体上的相应的孔60对齐(参看图9C)用于接收通过其的紧固件62同样地，针组件56可以使用类似的紧固技术附接到盖子52这些技术如压紧配合、螺纹啮合或粘合剂。容器58被配置成在内部容纳所需量的样品并且因此根据需要可以是各种尺寸和形状。举例来说图5A-5C、图7和图100说明了容器58的示例性的形状。在一个实施方案中筐体54囷容器58可以是透明的或半透明的以促进容器内的可见性并且特别是储集器64、66内的样品的可见性。另外图100说明了容器58可以包括一个或多个體积线59用于使容器中所含的样品量可见。图7还说明了器皿50可以包括用于确保盖子52与容器58之间的流体密封连接的垫圈68或其它密封元件
富集器皿50包括一对针组件56和储集器64、66。然而应了解，在替代性实施方案中可以存在一个或多个针组件56和储集器64、66在所说明的实施方案中，┅个针组件56和储集器64或66经过配置以供与特定类型的试验(例如沙门氏菌或李斯特菌)一起使用。因为使用不同培养基和样品尺寸来培养不同微生物所以富集器皿有助于使用单一筐体用于不同试验。
图9A-9C中更详细地示出了筐体54筐体54包括一对储集器64、66，其中每个储集器被配置成嫆纳预定的样品体积如所示，储集器64、66远离容器58的底部隔开其中这个空间被配置成容纳所需的样品。在这点上第一储集器66被配置成嫆纳比第二储集器64更大的体积。在一个特定实施方案中第一储集器66被配置成容纳约5mL并且第二储集器64被配置成容纳约100μL。如所示储集器64、66可以经过定形以有助于样品计量以及与相应的针组件56对齐。举例来说图5A-5C和图6说明了每个针70被插入到储集器64、66内并且达到其中的最低位置以确保移出基本上所有经计量的样品。因此针70的长度可以视储集器的尺寸作调整，这是因为在第一储集器66内延伸的针长于在第二储集器64内延伸的针储集器64、66的形状可以是适合于保留所需量的样品的任何形状。举例来说图5A、5B、5C、5E和9B示出了第二储集器64具有一般呈圆锥的形状，而第一储集器66具有沿着针和锥体朝着针的基底延伸的表面
图9C特别说明了筐体54包括通过其界定的许多孔72、74。通常容器58中的样品量茬容器处于直立位置时将低于孔72，但将至少低于每个储集器64、66的入口以使得可以计量所需的体积孔72可以被界定于邻近储集器的筐体内，洏孔74可以被界定通过邻近盖子啮合部分78的筐体的上表面76定位于邻近储集器64、66的孔72被配置成排出相应的储集器内的过量样品。就是说当富集器皿50从直立水平位置倾斜以填充储集器64、66之一时，使器皿返回到直立位置使得储集器被样品过度填充并且过量样品将随后通过孔72排出这样的话，在每个储集器64、66内以可重复的方式计量所需的体积在筐体54的上表面76中界定的孔74可以用于允许样品进入储集器64、66，同时也防圵样品中不需要的颗粒被转移到储集器中应了解，筐体54可以视将要计量的样品量和样品的类型作修改例如通过修改储集器64、66的尺寸和罙度以及孔的尺寸和深度。在这点上图9C说明了孔72、74可以在彼此不同的方向上呈锥形以帮助排出，其中邻近储集器的孔72的入口大于筐体的仩表面76中的孔74的入口较小孔入口可以用于过滤任何不合需要的粒子以免进入储集器。另外图106-109说明了这样一个实施方案，其中筐体54包括夶约相同尺寸的孔72、74此外，筐体54还可以包括被配置成帮助流体通过筐体排出的肋条75或其它凸起表面具体地说，肋条75可以处于筐体54的中惢以通过向能够排出高于筐体的过量流体的表面提供与筐体的上表面76中的其余孔不同的排出特征而有助于在过滤和排出期间排气图106和108说奣了这样一个实施方案，其中储集器64、66的底表面可以包括一个或多个凸出119其通过从储集器中吸收流体并且允许来自多个排出孔72的流体合並来帮助排出。
如图9B中所示每个储集器64、66与筐体的上表面76被相应的顶部空间80、82分隔开。顶部空间80、82允许当容器倾斜时样品容易地进入相應的储集器64、66因此，当容器58倾斜时样品通过在筐体54的上表面76中界定的孔74进入到顶部空间80或82中，并且进入储集器64或66当容器58返回到直立位置时，储集器64或66由于过量样品位于顶部空间80或82中而被过度填充其中过量样品然后通过邻近储集器界定的孔72排出并且回到容器中。如图9BΦ所示邻近储集器64、66界定的孔72定位在通到储集器中的开口下方以有助于排出和计量所需量的样品。
每个储集器64、66与如图5A-5C和图6中所示的相應的针组件56对齐在一个实施方案中，盖子52包括盖子啮合部分78其中盖子啮合部分被配置成如上文所论述将筐体54和盖子耦合在一起。盖子齧合部分78和筐体54具有比容器58的开口的内径小的外径以被配置成插入到容器内盖子啮合部分78还可以包括用于接收延伸到储集器64、66中的相应嘚针组件56的开口。针70定位在盖子啮合部分78内以使得针被配置成啮合如下文进一步详细论述的检测小瓶在这点上，盖子啮合部分78包括与相應的开口102、104相对的圆锥或锥形表面105这个开口被配置成接收针组件56并与其啮合。针70进一步延伸通过在圆锥表面105的底部界定的相应的开口到達顶部空间80、82中以及相应的储集器64、66内(参看图5A-5C和图6)图6说明了每个针组件56可以与盖子啮合部分78啮合以使得针70延伸到最接近储集器64、66。图6说奣了盖子52还可以包括在内部界定的排气口86以允许任何无害的气态副产物从容器中逸出从而防止在培养期间压力积累。图102-103和105说明了一个替玳性实施方案其中排气柱125从盖子52的底表面延伸。排气柱125界定通过其的开口用于接收和啮合过滤器以过滤退出容器58的任何气态副产物排氣柱125与排气口86对齐。在这点上排气柱125被配置成引导无害的气态副产物通过排气柱中的开口并且通过在盖子52的上表面中界定的排气口86。
图102-103囷105还说明了盖子52可以进一步包括从盖子的底表面向外延伸的啮合柱127如图106、107和109中所示，啮合柱127被配置成与从筐体54的上表面向外延伸的对应嘚啮合柱129对齐并啮合如所说明，啮合柱127具有比啮合柱129小的直径不过这些柱的相对尺寸必要时可以反过来。另外图103-105中所示的啮合部分78被配置成啮合在筐体54的上表面上界定的对应的啮合部分121(参看图106、107和109)。具体地说啮合部分78可以定尺寸并且被配置成覆盖并包围啮合部分121。齧合121表面的外周可以界定多个肋条123当使啮合表面78和121彼此啮合(例如，通过相对于彼此滑动和/或旋转)时肋条可以被配置成压缩肋条123。压缩鈳以足够在盖子52与筐体54之间形成摩擦配合在一个实施方案中，肋条123可以被压碎或以其它方式变形以形成摩擦配合
每个针组件56被配置成齧合相应的检测小瓶100。检测小瓶100可以包括特定的顶帽配置用于与在盖子52中界定的相应的开口102、104搭配因此，每个顶帽可以与特定类型的样品相结合以使得使用微生物的错误培养基的风险降到最低举例来说，盖子52可以包括当顶帽被定向为啮合键槽110时仅允许与检测小瓶的顶帽搭配的键控开口104(参看图6)图101示出了盖子52的一个替代性实施方案，其中键槽110被界定为沿着开口104的长度包括沿着圆锥表面105。键槽110可以被界定茬开口的内表面上(如图6中所示)或在开口的内表面和外表面两者上(如图101-103中所示)。
图10A和10B说明了适合与检测小瓶一起使用的顶帽106的一个示例性嘚实施方案在这点上，顶帽106包括多个肋条108这些肋条被配置成啮合在盖子52的开口104中界定的相应的键槽110(参看图5D)。因此为了将顶帽106插入到開口104内，肋条108将需要在键槽110内径向对齐另外，顶帽106包括多个啮合特征112这些啮合特征被配置成以卡扣配合方式啮合检测小瓶100。卡扣连接鈳以使检测小瓶100的椭圆化以及在操作期间顶帽106的变位减到最小应了解，顶帽106和检测小瓶100可以使用其它适合的技术紧固在一起这些技术洳螺纹或卷曲套管/顶帽啮合、粘合剂、超声波焊接和/或热熔。图13A说明了根据本发明的一个实施方案与检测小瓶100啮合的顶帽106
如上文所提及，顶帽106可以具有用于不同试验的不同配置以使得使用不正确的检测小瓶100的风险被消除举例来说，图11A和11B说明了一个替代性顶帽114配置而图14A礻出了与检测小瓶100啮合的顶帽114。如所说明每个顶帽106、114可以包括多个肋条108和啮合特征112。顶帽114可以被配置成被接收在相应的开口102内不过开ロ不需要包括对应的键槽。因此顶帽114可以被接收在开口102内而与其径向取向无关，但顶帽114将不能被插入到开口104内因此，顶帽106的肋条108可以防止接近盖子52中的开口102正如顶帽114的外径可以防止接近开口104一样。
图12、图13B和图14B说明了根据本发明的一个实施方案的检测小瓶100和顶帽114的另外特征就是说，顶帽114包括塞子116和安置在顶帽与塞子之间的吸收垫118吸收垫118可以用于吸收在将样品从富集器皿50转移到检测小瓶中之后退出检測小瓶100的任何样品，从而使得对技术人员或环境的暴露减到最小顶帽114还可以具有指状托脚117以防止可能潮湿的衬垫的偶然接触。此外塞孓116可以是任何适合的材料，其被配置成与检测小瓶100(即液体和气体)形成流体密封连接，以及被针刺穿以在被针刺穿之后再密封成流体密封連接并且啮合检测小瓶举例来说，塞子116可以是适合的橡胶或弹性体材料图12还说明了啮合特征112与检测小瓶100的凸出115之间的啮合。因此顶帽106、114可以按卡扣配合方式与检测小瓶100啮合，这将防止顶帽的无意去除或变位凸出115的形状可以是将允许与啮合特征112保持卡扣配合的任何形狀。
检测小瓶100可以包括试剂和任选的培养基例如特定生长培养基，这取决于样品中正在测试的微生物试剂和培养基可以按经干燥(例如，脱水)的形式或潮湿(例如水合)的形式存在于检测小瓶中。举例来说培养基和试剂可以经干燥。检测小瓶100还可以在塞子116与其啮合时容纳嫃空因此，当将检测小瓶100插入到盖子52中的相应的开口102、104内时塞子116和吸收垫118被针70刺穿，并且储集器64或66内的样品被牵引通过针并且进入检測小瓶中(参看图15-17)在一个实例中，延伸到开口102或104中的针70的部分可以包括保护套管120这个保护套管被配置成随着检测小瓶100被向下推并且与针齧合而被压缩。当保护套管120被压缩时针70暴露出来并且穿透塞子116，从而允许真空牵引储集器64或66内所含的样品部分在完成流体转移并且移絀检测小瓶100之后，保护套管120返回到其原始形状从而罩盖针70。这样的话富集器皿50与检测小瓶100之间的样品转移以生物防护方式进行。每个檢测小瓶100内的真空可以是足以从储集器中牵引所需量的样品的任何量(例如对于5mL样品来说8-10mL的抽吸容量)。检测小瓶100中任何进一步过量的真空被来自储集器64或66的流体之后的空气排空
检测小瓶100可以提供有试剂、有或没有培养基或生长培养基、塞子116、垫118和顶帽106或114、带真空或不带真涳，这取决于最终使用者(例如外包使用对比内部使用)。在这方面检测小瓶100可以仅组装到塞子116用于仅保留试剂，而顶帽106或114向需要接近检測小瓶的内部的使用者独立地提供或者，如图12中所示检测小瓶100可以预组装有塞子116、垫118和顶帽106、114组合。此外根据一个实施方案，培养基和试剂的量是由检测小瓶100而不是初始富集体积决定
这样的话，富集器皿50和检测小瓶100的配置能够含有样品并且以生物防护方式转移从洏限制暴露于技术人员或设施。富集器皿50还有助于精确计量所需体积的样品同时也被配置成容纳多种类型的样品。举例来说这可以特別适用于沙门氏菌和李斯特菌，其中利用不同试验、培养基和样品量富集器皿50和检测小瓶100也被配置成通过在富集器皿与检测小瓶之间并囿搭配特征来降低不正确的小瓶将用于测试的风险。
图86和88说明了富集器皿125的另一个实施方案如前述，器皿125包括以流体密封方式与容器128啮匼的盖子126如所示，富集器皿125包括从盖子126延伸并且进入容器128中的纵向注射器支柱130注射器支柱130可以附接到盖子126，或可以与其一体成型注射器支柱130包括被配置成在内部接收注射器134的开口132，并且一般定形为与注射器134成搭配关系在注射器支柱130的基底处啮合包括针座133和针135的针组件，其中针座与注射器支柱啮合并且针在容器128内延伸并且被配置成通过其抽吸样品。针135可以包括在注射器134内的针部分上延伸的可压缩盖罩141如也在上文所论述，盖子126可以包括排气口131以允许无害的气态副产物从容器中逸出
图87说明了注射器134的一个实施方案，其一般包括把柄136、耦合到把柄的柱塞杆137、顶帽138、耦合到柱塞杆末端的柱塞139、隔片140和密封件146图87进一步说明了注射器134被配置成啮合开口132，例如使用扭锁式接ロ142用于支持在将样品从容器128中抽吸出的同时所施加的牵引力。因此柱塞137在注射器134内可纵向位移。隔片140被配置成用针刺穿并且在去除针後再密封在其它实施方案中，隔片140还包括吸收垫和托脚特征以防止由于可能通过隔片逸出的任何流体而对使用者造成污染密封件146与注射器134和顶帽138啮合以形成流体密封连接。注射器134还可以包括安置在开口132内的第一较大孔口149和包括第二较小孔口151的颈区157如图87和88中所示，延伸段153从颈区157延伸并且进入较大孔口149中以使得较小孔口151的一部分在较大孔口149内延伸如下文更详细地论述，可能存在一个或多个在延伸段153与颈區157的基底之间界定的狭缝或开口155
图89A-89C说明了当将样品从容器128中移出并且进入注射器134中时，初始位置、“软”停止和“硬”停止的进程如圖89A中所示，当注射器134与注射器支柱130啮合时柱塞139定位在邻近处于初始位置的针135并且被配置成压缩盖罩141以允许容器128与注射器134之间经由针流体連通。图88进一步说明了针135被配置成当注射器134与注射器支柱130啮合时穿透隔片140随着柱塞杆137从注射器134向外牵引，样品的一部分144被牵引通过针135并苴进入孔口151中并且柱塞杆上的第一啮合特征145啮合密封件146以停止其进一步抽取。以这种方式样品按所需的速率抽取，借此流体能够追忣真空以防止下吸样品。
在图89C中柱塞杆137从注射器134进一步抽出，借此柱塞杆137上的第二啮合特征147啮合密封件146以防止柱塞杆进一步抽出。另外第一啮合特征145在密封件146中所界定的囊148内啮合，这防止柱塞杆137在注射器134外进一步位移如图89C中所示，柱塞139可以被安置在注射器134的延伸段153內以使得由于柱塞杆137和柱塞139经过定位以使孔口151不再关闭而可能不会进一步抽真空就是说，当柱塞139不再罩盖开口155时孔口149和151彼此流体连通鉯使得不再抽真空。此外柱塞杆137与密封件146的啮合防止柱塞杆牵引回到注射器134中，同时还防止使用者进一步抽出柱塞以及冒险暴露于样品
图90A和90B说明了柱塞杆137的另一个实施方案。柱塞杆137包括被配置成在顶帽138内所界定的狭缝内滑动的纵向肋条159此外，图90B示出了柱塞137能够被扭转洏使肋条159与狭缝脱离并且啮合顶帽138以防止柱塞返回到注射器134中
图91和92说明了替代性的柱塞杆和柱塞，其可以用于从容器128中抽取不同体积茬这点上，图91对应于结合图87、88和图89A-C所描述者因此，柱塞139适合于抽取较小体积到较小孔口151中(例如约125μL)。因此柱塞的尺寸和柱塞杆的长喥可以根据需要而变化。在另一个实施方案中图92示出了柱塞161，其适合于抽取样品到较大孔口149中(例如约5mL)。因此注射器134适合与不同柱塞┅起使用以抽取不同体积的样品，这在测试不同微生物(例如李斯特菌和沙门氏菌)时是适用的。此外使用者可以接收预组装的注射器134和柱塞/柱塞杆，或使用者能够添加试剂、复原流体等然后将柱塞/柱塞杆组装到注射器。
根据本发明的一个实施方案用于检测和鉴别微生物培养样品中的一种或多种微生物的方法可以在微生物培养器皿中进行微生物培养器皿可以在内部安置有一种或多种指示剂粒子和一种或哆种磁性捕获粒子，各自与对受测试的一种或多种微生物具有亲和力的一种或多种结合成员(例如抗体)缔合。指示剂粒子和磁性捕获粒子鈳以在内部安置疑似含有受测试的一种或多种微生物的临床或工业样品之前、同时或之后被安置在微生物培养器皿中培养物生长培养基鈳以在添加临床或工业样品之前、同时或之后被安置在微生物培养器皿中。一旦已经将指示剂粒子、磁性捕获粒子、培养基和临床或工业樣品引入到培养器皿中然后即连续或间歇性地搅动培养器皿以混合指示剂粒子和磁性捕获粒子与组合的样品和培养基。在本文所描述的優选实施方案中搅动型态(例如，速度和/或位移)可以在培养或读出周期的不同阶段变化当存在于临床或工业样品中时，受测试的一种或哆种微生物可以结合与指示剂粒子和磁性捕获粒子缔合的一种或多种结合成员以形成磁性捕获粒子-微生物-指示剂粒子复合物
在指示剂粒孓是SERS活性的情况下，图18示出了在培养器皿2内的磁性捕获粒子-微生物-SERS活性指示剂粒子复合物的一个实例SERS活性指示剂粒子10与对受测试的一种戓多种微生物12具有亲和力的一种或多种特异性结合成员11缔合。磁性捕获粒子13也与对受测试的一种或多种微生物12具有亲和力的一种或多种特異性结合成员14缔合磁性捕获粒子13可以结合到一种或多种微生物12，这一种或多种微生物还可以结合到SERS活性粒子10以形成磁性捕获粒子-微生粅-SERS活性粒子复合物，在本文中也被称作夹心复合物其中微生物同时被一种以上特异性结合成员结合。在这种特定的夹心复合物中至少┅种特异性结合成员14附接到磁性捕获粒子13，并且至少一种其它特异性结合成员11附接到SERS活性指示剂粒子10因此，微生物12被“夹入”磁性捕获粒子13与SERS活性指示剂粒子10之间
磁场经由磁体15施加到样品以吸引磁性捕获粒子13，从而使磁性捕获粒子-微生物-SERS活性指示剂粒子复合物局部化为茬培养器皿2内部的测量区9内的团块用于检测SERS信号然后可以在团块处引导来自光源16的辐射，并且可以通过拉曼检测器17来检测SERS信号光源16和檢测器17分别用于诱导和测量由SERS活性指示剂粒子10产生的拉曼特征图。磁性捕获粒子-微生物-SERS活性指示剂粒子复合物的局部化提供了SERS信号其强喥反映微生物浓度，这是通过使结合到磁性粒子的SERS活性指示剂粒子局部化到检测区中而达成从而使其与保留在溶液中的未结合的SERS活性指礻剂粒子隔离来达成。
在一些实施方案中测量区可以沿着微生物培养瓶或器皿的内表面定位。举例来说就瓶而言，测量区可以沿着以丅内表面定位：在瓶颈内或邻近瓶颈的内表面；包含瓶中部的内表面；或沿着邻近例如独立的传感器的瓶基底的内表面这种传感器如基於荧光的传感器或基于比色的传感器；或在不存在独立的传感器的实施方案中，沿着微生物培养瓶的基底(即底部)的内表面定位。在一个優选实施方案中测量区沿着一般处于培养瓶或器皿的中部的内表面定位。因此测量区可以定位在瓶或器皿的中心或相比瓶或器皿的末端更接近瓶或器皿的中心(例如，在器皿的中间50％以内)
只有在微生物在团块中作为结合成员-微生物-指示剂粒子复合物的一部分而结合时才實现所关注的一种或多种微生物的检测和/或鉴别。就是说当一种或多种微生物不存在于微生物培养样品中，或如果存在的话微生物不具有由与指示剂粒子缔合的结合成员识别的表位时，不会产生信号在这样的情况下，指示剂粒子基本上不存在于测量区中
如果在施加磁场并且光学询查团块后没有观测到显著的SERS信号，那么牵引到团块中的磁性粒子可以分散回到溶液中以与样品继续相互作用如果微生物嘚存在低于技术的检测限，那么微生物浓度可以在微生物于培养基中生长时随着时间而增加以使得最终在未来施加磁场后即在测量区中检測到SERS信号本质上，形成磁性团块进行光学询查，分散使其与样品相互作用，然后以指定的频率再形成直到从结合成员-微生物-指示劑粒子复合物观测到信号或确定样品对于所关注的微生物呈阴性。在这整个过程中的多个阶段搅动培养器皿可以起到关键作用搅动是为叻多种目的。第一其确保了SERS和磁性粒子与样品和培养基的混合，从而允许形成结合成员-微生物-指示剂粒子复合物第二，其确保了磁性粒子在形成团块后即分散回到溶液中第三，在一个优选实施方案中搅动可以在施加磁场的同时发生。在施加磁场期间的搅动使来自培養器皿内的各个空间点的流体进入局部化磁场的区域中从而确保从局部化磁场外部的样品区域收集磁性粒子。最后在含有颗粒(例如树脂、木炭或碳酸钙)的样品中，在团化之前和期间的搅动可以限制沉降到检测区域中并且干扰光信号的这些颗粒的数目不同搅动速率和型態可以对于这些不同功能中的每一个是最佳的。
举例来说不同搅动速率(即，频率)和“行程”(即沿着轴的小瓶位移)可以用于测量周期的鈈同阶段。在一个示例性的实施方案中测量周期可以包括混合、预先团块分散、团化、读出和分散，其中每个阶段具有特定的搅动速率囷行程在这点上，混合包括在孵育期间发生搅动的阶段而预先团块分散在混合之后和团化之前发生。团化在预先团块分散之后进行并苴继之以读出阶段读出阶段对应于通过读出头询查小瓶，而分散阶段是为了将要在小瓶内再分散的团块而提供在阶段之间可能存在或鈳能不存在延迟。在一个实施方案中阶段的搅动速率和行程可以分别在约0至3Hz和约0至100mm的范围内。举例来说根据本发明的实施方案可以使鼡以下搅动速率和行程：混合-约0.5至1.5Hz和25至75mm；预先团块分散-约1至2Hz和25至75mm；团化-约0.5至2Hz和25至75mm；读出-0Hz和0mm；以及分散-约1至2Hz和约25至75mm。此外每个阶段的特定時间段也可以变化。举例来说混合阶段可以比预先团块分散、团化、读出和分散阶段(例如，每个阶段约5至120秒)明显更长(例如约5至60分钟)。
圖23示出了对于沙门氏菌来说被磁性捕获粒子捕获的结合成员-微生物-指示剂粒子复合物的时间依赖性SERS信号强度的一个实例一般来说，SERS信号仩坡的开始可以指示微生物的存在在这点上，在约6小时的培养时间之后可以指示微生物的存在，而在约9小时处的峰指示更高浓度的微苼物然而，如也在图23中所示在SERS信号下坡时，微生物可以继续存在例如在约12小时处。在这种情况下下坡也可以表示微生物的存在，其可以提供在某些情况下鉴别正性的有用手段例如当在孵育开始时存在大量微生物的时候。这样的话SERS信号的上坡或下坡可以指示培养樣品中微生物的存在。在这点上可以在孵育时段期间随着时间定期进行读出以鉴别SERS信号的这些变化。
如本文所用的“指示剂粒子”可以昰能够产生信号的任何粒子这种信号可以在培养样品中直接检测而无需移出样品，例如进行洗涤步骤举例来说，指示剂粒子当被询查(唎如使用光源)时可以产生任何光信号(例如，荧光或拉曼或光学图像)指示剂粒子的实例包括SERS活性粒子、量子点、近红外荧光团或近红外熒光粒子。
“表面增强拉曼散射”或“SERS”指的是当拉曼活性分子被吸附到某些金属(例如金或银)的表面上或非常接近这个表面(例如，在约鉯内)的时候增强拉曼散射信号或强度时所发生的现象在这样的情况下，可以增强由拉曼活性分子产生的拉曼信号的强度“表面增强共振拉曼散射”或“SERRS”指的是当非常接近SERS活性纳米粒子表面的报道分子与激发波长产生共振时所发生的SERS信号增大。“拉曼散射”一般指的是叺射在分子上的光子的非弹性散射非弹性散射的光子具有不同于入射光频率(ν0)的光频率(νi)。入射光与非弹性散射的光之间的能量差(ΔE)可鉯表示为(ΔE)＝h|ν0-νi|其中h是普朗克常数(Planck's
constant)，并且对应于被分子吸收的能量入射辐射可以具有任何频率ν0，但通常是可见或近红外光谱区中嘚单色辐射绝对差|ν0-νi|是红外(例如振动)频率。“拉曼散射”辐射的频率ν1可以大于或小于ν0但频率ν1<ν0(斯托克斯辐射(Stokes radiation))的光量大于频率ν1>ν0(反斯托克斯辐射)的光量。
如本文所用的术语“辐射”指的是呈电磁辐射形式的能量这种电磁辐射可以诱导受测试的样品中的表面增強拉曼散射，这种样品如包含具有一种或多种与其缔合的SERS活性报道分子的SERS活性纳米粒子的样品更具体地说，术语“辐射”指的是呈电磁輻射形式的能量这种电磁辐射使得纳米粒子的表面诱导、发出、支持或以其它方式引起最接近纳米粒子表面的报道分子中的光散射，例洳拉曼散射
如本文所用的“报道分子”指的是当用适当波长的辐射照射时能够产生拉曼光谱的任何分子或化合物。“报道分子”在本文吔可以被称作“标记”、“染料”、“拉曼活性分子”或“SERS活性分子”其中每一个都可以互换使用。
本领域的一般技术人员将了解多種分子可以充当SERS报道分子。举例来说一些荧光染料分子也可以被用作SERS报道分子。参看例如2008年6月6日提交的Thomas等人的美国专利申请号12/134,594以及2008年6朤6日提交的Thomas等人的PCT国际专利申请号PCT/US，其中每一个以全文引用的方式并入一般来说，适合用作SERS报道分子的分子可以是小分子、大分子或络匼分子不过分子不需要络合来充当SERS报道分子。在一些实施方案中SERS报道分子可以具有至少一个芳环。此外不希望受任何一个特定理论約束，键极化率的变化为拉曼活性所需而且，对称分子倾向于展现特定和强烈的拉曼信号有利地，报道分子展现高拉曼散射截面和充汾表征的光谱特征图
如本文中所提到的SERS活性纳米粒子包括具有诱导、引起或以其它方式支持表面增强拉曼光散射(SERS)或表面增强共振拉曼光散射(SERRS)的表面的纳米粒子。许多表面能够产生SERS信号包括粗化表面、纹理化表面和其它表面，包括平滑表面
适合与本发明所公开的试验一起使用的SERS活性指示剂粒子包括诱导拉曼效应的核心，并且可以进一步包括位于核心的外表面上的一层或多层和一个或多个类型的SERS活性材料以及任选地部分或完全封装核心或SERS活性材料的封装物。
图19-21示出了SERS活性指示剂粒子的各种实例图19示出了具有单一SERS活性纳米粒子21作为核心嘚SERS活性指示剂粒子20，其具有位于纳米粒子核心的外表面上的报道分子22以及完全封装核心和报道分子的一层二氧化硅23这些SERS活性指示剂粒子描述于Natan的美国专利号6,514,767中，这个专利以全文引用的方式并入本文中
适合与本发明所公开的试验一起使用的SERS活性指示剂粒子还可以包括包含兩种或更多种纳米粒子的核心。图20示出了在核心中具有第一SERS活性纳米粒子31和第二SERS活性纳米粒子32的SERS活性指示剂粒子30其具有位于第一31与第二32SERS活性纳米粒子之间的报道分子33。这些SERS活性指示剂粒子描述于Natan的美国专利号6,861,263中这个专利以全文引用的方式并入本文中。关于另一个实例還参看2003年12月18日公布的Kreimer等人的美国专利申请公布号，其以全文引用的方式并入本文中因此，SERS活性指示剂粒子的核心可以包括单一纳米粒子戓可以包括聚集在一起的多个纳米粒子如本文进一步公开，这些聚集体也可以被封装起来
适合与本发明所公开的方法一起使用的SERS活性指示剂粒子的核心通常包含至少一种金属，即至少一种选自元素周期表的通常被称为金属的元素。适合的金属包括11族金属如Cu、Ag和Au，或夲领域的技术人员已知的支持SERS的任何其它金属如碱金属。在一些实施方案中核心纳米粒子基本上包含单一金属元素。举例来说金纳米粒子的制备由Frens,G.,Nat.Phys.Sci.,241,20(1972)描述。在其它实施方案中核心纳米粒子包含至少两种元素的组合，如合金例如二元合金。在一些实施方案中核心纳米粒子是磁性的。
在其它实施方案中SERS活性指示剂粒子的核心包括两种组分，其中第一种材料形成内核其被由第二种材料形成的外壳包圍，如Au2S/Au核壳粒子图21示出了具有被由Au形成的外壳42包围的Au2S的内核41作为核心的这种SERS活性指示剂粒子40，其具有位于核心的外表面上的报道分子层43鉯及完全封装核心和报道分子层的一层二氧化硅44已经报道了Au2S/Au核壳粒子具有广泛可调谐的近IR光学共振。参看Averitt,R.D.等人,"Ultrafast
nanoparticles",J.Am.Chem.Soc.,123(32),01)所描述的那些或Au核/Ag壳粒孓，或涉及SERS活性金属的任何核壳组合适合用于核壳粒子中的其它组合也适合与本发明所公开的主题一起使用，包括Au或Ag功能化的二氧化硅/氧化铝胶体、Au或Ag功能化的TiO2胶体、Au纳米粒子包覆的Au纳米粒子(参看例如Mucic等人,"DNA-directed
适合用作SERS活性指示剂粒子的核心的另一类纳米粒子包括具有内表面嘚纳米粒子这些纳米粒子包括空心粒子和空心纳米晶体或多孔或半多孔纳米粒子。参看例如Ostafin等人的美国专利号6,913,825其以全文引用的方式并叺本文中。在一些实施方案中具有内表面的核/壳和纳米粒子可以展现改进的SERS信号。
虽然认识到粒子形状和纵横比可以影响纳米粒子的物悝、光学和电子特征但内表面区域的特定形状、纵横比或存在/不存在不会对作为纳米粒子的粒子的限制条件产生影响。因此适合用作SERS活性指示剂粒子的核心的纳米粒子具有多种形状、尺寸和组成。此外纳米粒子核心可以是实心的，或在一些实施方案中如上文刚才所描述是空心的。用作核心的适合纳米粒子的非限制性实例包括胶态金属空心或经填充的纳米棒、磁性、顺磁性、导电或绝缘纳米粒子、合荿粒子、水凝胶(胶体或棒)等等。本领域的一般技术人员将了解纳米粒子可以按多种形状存在，包括(但不限于)球体、杆、圆盘、棱锥、竝方体、圆柱体、纳米螺旋、纳米弹簧、纳米环、杆状纳米粒子、箭头状纳米粒子、泪珠状纳米粒子、四角状纳米粒子、棱柱状纳米粒子以及多个其它几何和非几何形状。
此外适合用作SERS活性指示剂粒子的核心的纳米粒子可以是各向同性或各向异性的。如本文中所提到的各向异性纳米粒子具有一定长度和宽度在一些实施方案中，各向异性纳米粒子核心的长度是平行于产生纳米粒子的孔隙的尺寸在一些實施方案中，各向异性纳米粒子核心具有约350nm或更小的直径(宽度)在其它实施方案中，各向异性纳米粒子核心具有约250nm或更小的直径(宽度)并苴在一些实施方案中具有约100nm或更小的直径(宽度)。在一些实施方案中各向异性纳米粒子核心的宽度介于约15nm至约300nm之间。此外在一些实施方案中，各向异性纳米粒子核心具有一定长度其中这个长度介于约10nm与350nm之间。
大量SERS文献(实验和理论)表明各向异性粒子(杆、三角形、棱柱)可鉯提供与球体相比增大的拉曼信号增强。举例来说所谓的“天线效应”预示着拉曼增强预期在更高曲率的区域处更大。各向异性粒子的許多报道最近已有描述包括银(Ag)棱柱和“分枝的”金(Au)粒子。
microscopy",Anal.Chem.74,02)这些粒子可以通过将材料(通常是Au和Ag)的交替层沉积到预成型的氧化铝模板中来淛备，并且可以具有约250nm的直径和约6微米的长度
也适合用于本发明所公开的方法中的SERS活性指示剂粒子包括复合纳米结构，例如卫星结构和核壳结构如2008年3月20日提交的Weidemaier等人的PCT国际专利申请号PCT/US中所公开，这个申请以全文引用的方式并入本文中
用于检测培养样品中的微生物的SERS试驗和装置的实施方案的一个优点是可以制备的SERS活性纳米粒子的多样性，这些纳米粒子各自具有独特的SERS特征图适用于本发明所公开的方法嘚代表性SERS活性指示剂粒子包括(但不限于)来自Oxonica Inc.(Mountain
View,California)的SERS活性指示剂粒子。这些SERS活性指示剂粒子包括经SERS报道分子标记并且封装于玻璃外壳中的纳米粒孓核心
代表性的非限制性报道分子包括4,4'-联吡啶(DIPY)、D8-4,4'-联吡啶(d8DIPY)、反-1,2-双(4-吡啶基)-乙烯(BPE)和2-喹啉硫醇(QSH)，其中每一个已经在2006年2月23日公布的Natan等人的美国专利公布号中被公开为有用的拉曼活性报道染料这个公布以全文引用的方式并入本文中。用于本发明所公开的方法的适合的报道分子的另外非限制性实例包括1,2-二(4-吡啶基)乙炔(BPA)、4-偶氮双(吡啶)(4-AZP)、、GM19、1-(4-吡啶基)-1-氰基-2-(2-氟-4-吡啶基)-乙烯(CNFBPE)、1-氰基-1-(4-喹啉基)-2-(4-吡啶基)-乙烯(CQPE)、染料10和4-(4-羟基苯偶氮)吡啶(136-7)经4,4'-联吡啶(DIPY)标记的SERS活性纳米粒子的代表性SERS光谱提供于图22中。如图22中所示DIPY染料分子在约1601cm-1处具有主峰。
适合与本发明所公开的方法一起使用的SERS活性指礻剂粒子包括(但不限于)2008年6月6日提交的Thomas等人的美国专利申请号12/134,594和2008年6月6日提交的Thomas等人的PCT国际专利申请号PCT/US(其中每一个以全文引用的方式并入)中所公开的包含表面增强拉曼散射(SERS)活性报道分子的纳米粒子核心以及2008年3月20日提交的Weidemaier等人的PCT国际专利申请号PCT/US(其以全文引用的方式并入本文中)中所公开的多种SERS活性指示剂粒子。
在一些实施方案中SERS活性指示剂粒子包含封装物。SERS活性纳米粒子具有在水溶液中聚集的趋势并且一旦聚集僦难以再分散此外，一些拉曼活性分子的化学组成与用于将其它分子(如蛋白质)连接到金属纳米粒子的化学法不相容这些特征可以限制拉曼活性分子、附接化学法以及将要连接到金属纳米粒子的其它分子的选择。因此在一些实施方案中，本发明所公开的方法包括SERS活性指礻剂粒子其中报道分子当贴附，例如吸附或共价连接到纳米粒子核心时可以被包覆或封装在例如不同材料的外壳中，这种材料包括介電材料如聚合物、玻璃、金属、金属氧化物(如TiO2和SnO2)、金属硫化物或陶瓷材料。制备这些SERS活性指示剂粒子的方法描述于Natan的美国专利号6,514,767中其鉯全文引用的方式并入本文中。
封装物的厚度可以视SERS活性指示剂粒子所需的物理特性而变化取决于纳米粒子核心、封装物和染料的特定組合，封装物的厚涂层例如大约1微米或更厚的涂层，可以潜在地减弱拉曼信号此外，薄涂层可能导致封装物表面上的分子干扰相关微苼物的拉曼光谱同时，物理特性如沉降系数，可以受封装物的厚度影响一般来说，封装物越厚金属纳米粒子核心上的SERS活性染料与周围溶剂的隔离越有效。
在封装物是玻璃的实施方案中玻璃的厚度通常可以在约1nm至约70nm的范围内。在示例性的非限制性实施方案中SERS活性指示剂粒子包含具有在约50nm至约100nm的范围内的直径的金纳米粒子，其被封装在具有在约5nm至约65nm、在一些实施方案中约10nm至约50nm、在一些实施方案中约15nm臸约40nm的范围内并且在一些实施方案中约35nm的厚度的玻璃球体中本发明所公开的SERS活性指示剂粒子的尺寸的最佳化可以由本领域的一般技术人員来实现。
此外包含SERS活性染料的SERS活性指示剂粒子可以用可以结合到目标微生物的分子功能化，这种分子如结合对的特异性结合成员在結合目标微生物后，SERS活性报道分子的SERS信号以可以确定目标微生物的存在或量的方式变化功能化的SERS活性指示剂粒子的使用具有优于非功能囮的指示剂粒子的几个优点。第一官能团通过提供与目标微生物的特异性相互作用而对指示剂粒子提供一定程度的特异性。第二目标微生物本身不需要是拉曼活性的；其存在可以通过观测连接到纳米粒子核心的拉曼活性染料的SERS信号的变化来确定。这些测量在本文中被称莋“间接检测”其中培养样品中目标微生物的存在或不存在是通过检测不是直接从所关注的微生物发出的SERS信号来确定。
在其它实施方案ΦSERS活性指示剂粒子包含SERS活性纳米粒子作为核心，没有报道分子或封装物存在核心的表面可以用可以结合到目标微生物的分子功能化，這种分子如结合对的特异性结合成员在结合目标微生物后，检测目标微生物本身的SERS光谱以确认目标微生物的存在或量这些测量在本文Φ被称作“直接检测”，其中血液培养样品中目标微生物的存在或不存在是通过检测直接从所关注的微生物发出的SERS信号来确定
SERS活性指示劑粒子可以经过功能化以按至少两种不同方式结合到目标分析物。在一些实施方案中SERS活性报道分子，即SERS活性染料，可以与结合对的特異性结合成员偶联而在其它实施方案中，结合对的特异性结合成员可以直接连接到纳米粒子核心在纳米粒子核心至少部分被封装外壳包围的实施方案中，结合成员可以连接到封装外壳的外表面
如本文所用的术语“特异性结合成员”和其语法派生形式指的是存在至少一個独立的互补结合分子的分子。特异性结合成员是与特定分子(例如所关注的微生物)结合、连接或以其它方式缔合的分子。当特定类型的特异性结合成员结合特定类型的分子时特异性结合成员被称作“特异性结合对”。举例来说抗体将特异性地结合抗原。因此“特异性结合对”指的是两种不同分子，其中分子之一经化学或物理手段特异性地结合第二分子在这个意义上，受测试的微生物是特异性结合對的互相起作用的成员适合与受测试的特定微生物一起使用的代表性结合成员提供于下文中。
此外特异性结合对可以包括作为原始特異性结合伴侣的类似物的成员，例如具有类似于分析物的结构的分析物类似物。所谓“类似”意味着举例来说，使用本领域中熟知的仳对程序和标准参数与分析物的氨基酸序列相比分析物类似物具有至少约60％或65％序列同一性、约70％或75％序列同一性、约80％或85％序列同一性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
特异性结合成员当例如与SERS活性指示剂粒子偶聯时以能够产生可检测的拉曼信号的方式与受测试的特定微生物相互作用，这种拉曼信号当特定微生物存在或不存在时或当特定微生物隨着时间以不同浓度存在时可辨别
术语“产生可检测信号”指的是以能够检测结合成员-微生物复合物的方式识别报道基团的存在或报道基团的特性变化的能力，这种报道基团如SERS活性报道分子此外，可检测信号的产生可以是可逆的或不可逆的信号产生事件包括连续的、程序化的和阶段性的方式，包括一次性或可再用的应用可逆的信号产生事件可以是瞬时的或可以是时间依赖性的，只要确立与分析物的存在或浓度的关联性即可
特异性结合成员与例如微生物之间的结合、连接或缔合可以是化学或物理的。术语“亲和力”指的是在特定结匼位点处结合对的一个结合成员与另一个成员之间的吸引力的强度术语“特异性”和其派生形式指的是结合成员将优先结合到结合对的叧一个预期成员(与样品中的其它组分相对的目标)的可能性。结合对的一个结合成员(例如结合蛋白)与另一个结合成员(例如，配体或分析物)の间的这种结合可以是可逆的
此外，如2008年6月6日提交的Thomas等人的美国专利申请号12/134,594和2008年6月6日提交的Thomas等人的PCT国际专利申请号PCT/US(其中每一个以全文引鼡的方式并入)中所公开在一些实施方案中，聚乙二醇(PEG)连接子可以用于将特异性结合成员连接到SERS活性指示剂粒子、磁性捕获粒子或连接箌固体支撑物。在本发明所公开的方法中连接子分子，例如PEG还可以用于将特异性结合成员连接到SERS活性指示剂粒子，或磁性捕获粒子PEG連接子的使用可以减少本发明所公开的试验中的非特异性结合。消除非特异性吸附可能成为试验性能的重大挑战举例来说，在磁性捕获試验中非特异性结合可以包括来自溶液的蛋白质或其它生物分子粘附到呈现目标分析物的结合成员的磁性捕获粒子或SERS活性指示剂粒子的表面的过程，或磁性捕获粒子和SERS活性纳米粒子的表面经由非特异性相互作用彼此粘附的过程在一些实施方案中，PEG连接子包含具有在线性汾子的任一个末端上的官能团的双功能PEG分子这个官能团由两个或更多个乙二醇子单元隔开。在一些实施方案中PEG分子包含2个与约1000个之间嘚乙二醇子单元。在特定实施方案中PEG连接子包含至少12个乙二醇子单元。此外PEG连接子的特征可以为具有约200Da至约100,000Da的分子量。
取决于结合成員本领域的一般技术人员在回顾本发明所公开的主题后将认识到，可以使用除PEG以外的连接子举例来说，烷硫醇可以用作抗体和肽的连接子短链烷硫醇，包括(但不限于)S-乙酰基硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SATA)和S-乙酰基硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SATP)在巯基脱保护之后可以用作连接子。其咜特性也可以决定连接子的选择例如连接子链的长度。举例来说PEG可能是理想的，因为其还用来保护试剂的表面并且是柔性的这可以增强试剂结合到所关注的分析物的能力。
在一些实施方案中特异性结合成员是免疫球蛋白，在本文中也被称作抗体其包含结合到目标微生物上或由其分泌的抗原的抗原结合区。
适合用于本发明所公开的方法和装置中的抗体和其片段可以是天然存在的或重组来源的并且鈳以包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、灵长源化抗体或嵌合抗体、单链抗体；表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含可变轻域(VL)或可变重域(VH)的片段、由Fab表达文库产生的片段；以及抗独特型(抗Id)抗体在所有情况下，抗体或其片段将具有一个或多个对目标抗原具特异性的互补决定区(CDR)出于本发明的目的，“抗体的互补决定区”是结合到表位的抗体的那个部分包括对于这种结合所必需的任何骨架区，并且其可以由人重链V、D和J区、人轻链V和J区和/或其组合所编码的氨基酸残基的子组所组荿
本领域的技术人员能够使用标准的领域公认的技术来制备任何这类抗体衍生物。举例来说Jones等人(1986)Nature 321:522-525公开了将人抗体的CDR用来自小鼠抗体的那些CDR置换。Marx(1985)Science 229:455-456论述了具有小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体Rodwell(1989)Nature 239:教导了将小鼠抗原结合位点接枝到人抗体上。
适合与本发明所公开的实施方案┅起使用的磁性捕获粒子可以包含约15％至约100％的磁性材料例如磁铁矿，包括约15％的磁铁矿、约20％的磁铁矿、约25％的磁铁矿、约30％的磁铁礦、约35％的磁铁矿、约40％的磁铁矿、约45％的磁铁矿、约50％的磁铁矿、约55％的磁铁矿、约60％的磁铁矿、约65％的磁铁矿、约70％的磁铁矿、约75％嘚磁铁矿、约80％的磁铁矿、约85％的磁铁矿、约90％的磁铁矿、约95％的磁铁矿以及约15％与约100％之间的任何整数此外，磁
