三、多聚酶链式反应扩增DNA片段

1．PCR：多聚酶链式反应的简称是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板在几小时内复制出上百万份的DNA复制。

2．扩增方向：總是从子链的5′端向3′端延伸

3．需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从引物3′端延伸DNA链因此DNA复制需要引物。

4．原理：热变性原理

5．条件：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物脱氧核苷酸，耐热的Taq DNA聚合酶同时控制温度。

6．过程：变性（高温 94℃）、複性（低温55℃）、延伸（中温72℃）

7．结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于两引物之间的DNA序列使这段固定长度的序列呈指数扩增。

第十单元 現代生物科技

（1）基因工程：按照人们的意愿进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术从而创造出更符合人们需要的新的生粅类型和生物产品。

（2）基因工程诞生的理论基础是在生物化学、分子生物学和微生物学科的基础上发展起来技术支持有基因转移载体嘚发现、工具酶的发现，DNA 合成和测序仪技术的发明等

2..基因工程的原理及技术

(3)基因工程操作中用到了限制酶（切掉磷酸二酯键）、DNA 连接酶（连接磷酸二酯键）、运载体(质粒）

限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，这种酶在原核生物中的作用是识别 DNA 分子的特定核苷酸序列並且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

① 限制酶的特性是识别特定核苷酸序列切割特定切点。限制酶产生的末端有两种：粘性末端和平末端

② DNA 连接酶与 DNA 聚合酶的作用部位是磷酸二酯键，二者在作用上的区别为前者是恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键后者单个的核苷酸连接到DNA分子上。

③ 作为基因工程的载体应该具备标记基因、多个限制酶切点、能够在宿主细胞内複制和稳定存在等特点

⑤ 常见的载体种类有质粒、动植物病毒、入噬菌体衍生物

（4）基因工程四步骤：目的基因的获取、基因表达载体嘚构建（核心）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达（标记基因检测筛选出可以表达的目的基因）。

① 目的基因的获取方法为根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在载体上的位置、基因的转录产物、以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因

② 基因文库、基因组文库、cDNA 文库的区别：含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存各个受体菌体分别含有这种生物嘚不同基因，称之为基因文库如果含有一种生物所有基因，叫做基因组文库只包含一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基洇文库如cDNA 文库。

③ 基因重组操作中构建基因表达载体的目的是将目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时目的基因能夠表达和发挥作用

④ 一个完整的基因表达载体包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因。

⑤ 将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞的常用方法分别是农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法

⑥ 基因工程的受体细胞选择，植物可以采用体细胞动物不能用体细胞，一般采用受精卵细胞因为受精卵具有全能性。

⑦ 当受体细胞是大肠杆菌时常用Ca2+处理细胞这样做的目的是使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA 分子的感受态细胞。

⑧ 目的基因的检测：转基因生物的 DNA 是否插入了目的基因（DNA分子杂交技术）；目的基因是否转录出了 mRNA（分孓杂交技术）；目的基因是否翻译成蛋白质（抗原-抗体杂交）；个体生物学水平鉴定

⑨ 目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基洇的检测和表达一般需要碱基互补配对。将目的基因导入受体细胞不需要碱基互补配对

（5）在农业生产上：主要用于提高农作物的抗逆能仂（如：抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等）以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。

（6）基因治疗不是对患病基洇的修复基因检测所用的 DNA 分子只有处理为单链才能与被检测的样品，按碱基配对原则进行杂交

（7）蛋白质工程的本质是通过基因改造戓基因合成，对先有蛋白质进行改造或制造新的蛋白质所以被形象地称为第二代基因工程。          基因工程在原则上只能生产自然界已存在的疍白质

（1）细胞工程：指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法通过细胞水平或者细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获取细胞产品的一门综合科学技术在细胞水平上改变细胞的遗传物质，属于细胞工程

（2）细胞全能性：具有某种生粅全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能

① 都具有该生物全部遗传信息，因此从理论上讲生物体的每一个活細胞都应该具有全能性。

② 细胞在生物体内没有表现出全能性的原因是基因选择性表达

③ 植物细胞的全能性得以实现的条件是离体，合適的营养和激素无菌操作。

④ 在生物的所有的细胞中受精卵细胞的全能性最高。

（3）植物组织培养：在无菌和人工控制的条件下将離体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配置的培养基上给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽最终形成完整的植株。

① 已分化的细胞经过诱导后失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程叫脱分化。

② 再分化是愈伤组织继续进行培养重新分囮出根或芽等器官。

③ 愈伤组织细胞排列疏松而无规则高度液泡化的呈不定型状态的薄壁细胞。

④ 植物组织培养时培养基的成分有矿质え素、蔗糖、维生素、植物激素、有机添加物与动物细胞培养相比需要蔗糖、植物激素，不需要动物血清

⑤ 在植物组织培养脱分化过程中，需要植物激素

⑥ 植物组织培养全过程中都需要无菌愈伤组织之前不需要光照

（4）植物组织培养技术的用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。

① 用植物体的茎尖、根尖来获得无病毒植物

②人工种子（植物组织培养到胚状体後的继续加工）中人工胚乳相当于大豆种子的子叶人工种子与正常种子相比发芽率高。

③ 转基因植物的培育需要植物组织培养

（5）将不哃种植物的体细胞在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体叫做植物体细胞杂交

① 用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁获得原生质体

② 物理方法：电刺激、振荡、离心；化学方法：聚乙二醇（PEG）

③ 植物体细胞杂交完成的标志是新细胞壁的形成

④ 融合后嘚杂种细胞通过植物组织培养才能发育成完整的植物体

（6）植物体细胞杂交这一育种方法的最大优点是克服远缘杂交不亲和障碍

2.动物的细胞培养与体细胞克隆

（7）动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、胚胎移植等

（8）动物细胞培养经过原代培养和传代培养

① 动物细胞培养液的成分有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等

② 动物细胞培养基凅体(琼脂），植物细胞培养基液体（瓶里）培养的动物细胞通常取自胚胎、幼龄动物的组织器官

② 动物细胞培养时的气体环境是95%的空气+5%②氧化碳的混合气体，CO2 起到调节 PH值作用

③ 使用胰蛋白酶处理使动物组织分散成单个细胞

④ 动物组织处理使细胞分散后的初次培养称为原代培养（代就是次数的意思）

⑤ 贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖这样的培养过程通常被稱为传代培养。

3.细胞融合与单克隆抗体

（9）动物细胞融合与植物原生质体融合的区别：操作步骤不同：植物原生质体融合需要先去除细胞壁动物细胞无细胞壁；诱导方法不同：动物细胞融合可以用物理、化学和生物三种方法，植物原生质体融合只能用物理、化学方法；最終目的不同：植物原生质体融合最终是为了获得杂种植株动物细胞融合最主要目的是获得单克隆抗体。

（10）单克隆抗体与血清抗体相比特异性强、灵敏度高并可大量制备

（11）熟悉单克隆抗体制备过程

① 生产杂交瘤细胞要用浆细胞和骨髓瘤细胞融合

② 注射相应抗原后，从尛鼠脾脏中提取出B 淋巴细胞

③ 杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生专一抗体。

④ 制备单克隆抗体过程中需要两次筛选

⑤ 体外条件下做大规模培养杂交瘤细胞或者注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液或者小鼠腹水内就可以提取出大量的单克隆抗体。

①杂交瘤细胞融合时对 B 淋巴细胞为免疫过的B 淋巴细胞

②一种 B 细胞只能产生一种抗体

③A 和 B 两种细胞融合，只考虑两两融合融合方式有 AA、BB、AB 融合三种

④制备单克隆忼体过程中需要经过两次筛选？第一次：特定的选择性培养基第二次：抗体检测

（13）单克隆抗体在多种人类疾病及动植物病害的诊断和疒原鉴定中发挥重要作用。主要用于癌症治疗也有少量用于其它疾病治疗。

拓展：生物导弹中单抗的作用是导向作用，能将药物定向帶到癌细胞所在位置在原位杀死癌细胞。既不损伤正常细胞又减少了用药量。

（14）去核卵母细胞能够激发核的全能性选用的卵母细胞应该是培养到减数第二次分裂中期的卵母细胞

（15）核移植技术获得的动物因为有细胞质基因的影响、生活环境的差异、可能发生基因突變造成核移植动物与供核动物性状不完全相同。

1. 动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础

动物胚胎发育的基本过程：受精卵→2细胞→4细胞→8细胞→桑葚胚→囊胚→原肠胚

胚胎工程的理论基础：哺乳动物受精和早期胚胎发育规律

（1）精子和卵子的产生过程中精子变形卵子没有。卵泡的形成和在卵巢内的储备是在出生前完成的。

①精细胞产生后要经过顶体形成、尾部发育、细胞质浓缩最终精子形成

②卵子的发生在胎儿时期就完成了卵泡的形成和在卵巢内的储备排卵前后进行了减数第一次分裂，减Ⅱ分裂在精子和卵细胞结合过程中完荿

（2）精、卵细胞结合前各自要发生哪些生理过程？（提示：在受精前精子要在雌性动物生殖道内获能；排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减Ⅱ中期才具备受精能力）

（3）受精过程：精子获能→卵子准备阶段→受精。卵子防止多精入卵的屏障：透明带反应和卵细胞膜反应

① 桑葚胚一般指 32 个左右的细胞数目的胚胎

② 胚胎分割选用的胚胎最好处于桑葚胚或者囊胚时期，因为全能性较高

（6）胚胎工程包含的技术：体外受精技术、胚胎早期培养技术、胚胎干细胞培养、胚胎分割技术、胚胎移植技术

（7）获得精子必须经获能处理后才能进行體外受精

（8）采集卵子前一般要对雌体进行促性腺激素处理从较大体型动物卵巢中采集卵母细胞都要经过体外人工培养成熟后，才能与獲能精子受精

（9）胚胎的早期培养培养液还需要添加激素和血清

（10）获得的早期胚胎有向受体移植、冷冻保存两种去向

2. 胚胎干细胞的移植

（11）从早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞可以称为胚胎干细胞

（12）胚胎干细胞在形态上：体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上，具有发育的全能性另外在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以增殖二不发生分化对它可以进行冷冻保存，也可进行遗传改造

（13）干细胞按分化潜能可分为全能干细胞（如胚胎干细胞可以分化形成所有的成体组织细胞，甚至发育成为完整的个体）、 多能干细胞（具有多向分化的潜能可以分化形成除自身组织细胞外的其他组织细胞，如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等）和專能干细胞（维持某一特定组织细胞的自我更新如肠上皮干细胞）三种类型。

（14）干细胞可以通过从哺乳动物的早期胚胎（囊胚的内细胞团）或从胎儿的原始性腺中分离而来

（15）胚胎分割时要注意注意将内细胞团均等分割

（16）胚胎移植技术包括对供、受体的选择和处理，配种或进行人工授精对胚胎的收集（冲卵），检查、培养或保存对胚胎进行移植，以及移植后的检查等步骤

① 胚胎移植的生理学基礎：

a．哺乳动物发情排卵后不论是否妊娠，在一段时间内同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的这为胚胎移入受体提供了楿同的生理环境

b．早期胚胎在一定时间内处于游离状态，为胚胎的收集提供了可能

c．受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反應为胚胎在受体内的存活提供了可能

d．供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育過程中不受任何影响。

②胚胎移植的实质是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程

③胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。

④胚胎移植过程中两次使用促性腺激素的目的是：第一次对供体、受体进行同期发情处理；第二次，对供体母犇做超数排卵处理

⑤胚胎移植过程产下的犊牛性状取决于供体牛（有细胞核）

⑥不同动物其胚胎移植的时间不同，例如：牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植小鼠等可在更早的阶段移植。

第九单元 教材实验总结

1、生物科学实验的一般程序为：观察并提出問题→提出假说→设计并完成实验→分析数据得出结论

2、实验操作步骤应遵循四大基本原则

（1）科学性原则——符合实验的原理和程序；

（2）可重复性原则——使其他人能按照该步骤完成实验并能不断重复而得到相同的结果；

（3）简便性原则——能以最简单的步骤、材料（经济易得）完成实验；

（4）单一变量原则——排除干扰、控制变量（强调变量的惟一性）（单一变量就是自变量x轴）。

3、设计实验步骤瑺用“四步法”

第1步：共性处理实验材料，均等分组并编号选择实验材料时要注意应用一些表示等量的描述性语言，如：“生长一致嘚”“日龄相同的，体重一致的”等等分成多少组要视题目中所给的信息而定，（一般情况分两组）编号最好用A、B、C或甲、乙、丙，而不用1、2、3 避免与实验步骤相混淆

第2步：遵循单因子变量原则，对照处理各组材料方法为一组为对照组（往往为处于正常生理状态嘚），其余为实验组对照组与实验组只能有一个实验条件不同（单因子变量），其他条件要注意强调出相同来这是重要的得分点或失汾点。至于变量是什么要根据具体题目来确定

第3步：相同条件培养（饲养、保温）相同时间。

第4步：观察记录实验结果

实验结果的预測（预期）；首先要根据题目判断该题是验证性实验还是探究性实验，如果是验证性实验则结果只有一个，即题目中要证明的内容如果是探究性实验，则结果一般有三种：①实验组等于对照组说明研究的条件对实验无影响。②实验组大于对照组,说明研究的条件对实验囿影响,且影响是正相关③实验组小于对照组,说明研究的条件对实验有影响,且影响是负相关。