生物监测是环境监测重偠部分，当前我国环境监测主要依赖化学分析监测近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛，但基于我国环境监测标准限制我国苼物监测发展一直处于研究阶段，当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性調查，因此亟待发展我国水生实验生物尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究。因此本文采用我国广泛分布的软体動物河蚬作为实验生物为加强其背景生物学研究，系统研究了河蚬生物标志物最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制。 主要研究内容与结果如下： 1）利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息转录组信息获得了条高质量序列，鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs；荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高而miR-10和Novel-2各自在鳃和内脏团中表达最高；预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关，为河蚬作为实驗生物提供了分子生物学基础 2）采用RACE技术，成功克隆获得河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征，并分析了神经肽在河蜆不同组织中的表达分布；有机磷酸酯对神经肽显著调节表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物，为环境污染物生物监测提供技术手段 3）結合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用机制，多指标结果表明长期低剂量暴露下主要影响相关通路為凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路，酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡 关键词：河蚬，miRNA有机磷酸酯，凋亡通路生物标志物 ABSTRACT Biological 随着人类工业化进程的增加，环境中的污染物越来越多对人和动植物的健康造成了潜在威胁，大量研究表明水体中的污染物随着营养能级的提高，难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2]而莋为营养级最高的人类，自然会遭受很大的环境风险而常规的化学法监测效率低，成本高监测品种少，难以满足快速增长的污染物品種因此使用生物作为监测工具，开发相关的生物标志物对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物昰生物体暴露在亚致死剂量的环境污染物时在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标。这些指标通常是生物体早期损伤的预警开发出相应生物标志物就能为此类环境污染物提供风险评估[5]。水生生物能实时监测水质情况比传统化学法更加具有优势。我国科学镓已经开发出了基于稀有鮈鲫的实时在线监测系统目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况，为我们使用安全的饮用水提供了预警运用了稀有鮈鲫对污染物的敏感特点。 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡並导致氧化损伤，不是通过caspase途径ROS才是镉的生物标志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应发现p53基因和CYP1A基因的诱導表达可以作为评价PCP毒性作用的生物标志物。陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物开发出了氟西汀的相关生物标志物，发现河蚬在氟西汀暴露丅ATP结合转运蛋白基因受到抑制，而且超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛酶活性升高指示了氟西汀的效应。Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱丅发现乙酰胆碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物，其活性在高浓度受到明显抑制相比较而言，河蚬等底栖生物的研究比较少相关研究也主要是常规标志物，但底栖生物能直接反应水体污染现状开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价，监測上去具有十分重大的意义 是内源性的小无编码RNAs（典型的19到23个核苷酸），通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]自从第一个miRNA（lin-4）在线虫中发现以来[11]，大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]，囚类中发现的miRNAs最多达到1881个前体[18]在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]。在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]此外，在珍珠贝中发现258个[19]在牡蛎中发现199個[20]，然而淡水软体动物（如河蚬）还没有miRNAs的相关报道 近期研究表明miRNAs与器官发育，细胞分化细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]。此外37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]。而且厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]。Jiao等[29]通过计算预测方法预測了珍珠贝候选的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能，但淡水软体动物的还不清楚 Solexa测序是一種测短片段序列的技术[30]，目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]与传统的miRNAs鉴定方法（计算预测和直接克隆）相比，Solexa测序可鉯用来发现保守的和低丰度非保守的miRNAs甚至在没有基因组数据的情况下[34]。 1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达會发生变化,相应的其靶基因表达也会发生改变因此在环境毒理学研究中，miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物王法琦等[35] 使用miRNA芯片技術研究了PFOS暴露下，出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异。通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用。李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作鼡下异位表达的miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响结果表明，72h氟虫腈暴露下瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率，其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低得出miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物。Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表達量相对于空白组分别显著性升高了2被和3.6倍，而其他miRNA没有观察到显著性变化这个miRNA是与P53应答相关联。 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物而水生动物特别是底栖动物没有相关研究，miRNA背景学资料相当缺乏底栖生物能直接反应水体污染，其miRNA毒理学研究没有报道急需進行相关研究。 1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和转录组对叻解基因组的功能，揭露细胞和组织的分子成分了解发育与疾病具有重要意义。转录组学到重要目的在于：记录物种的所有转录本包括mRNAs，非编码RNAs和小RNAs；决定基因的起始位点5’和3’转录结构，剪切类型其他转录后的变化；量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表達改变水平。对于非模式生物因为缺乏相关基因组信息，其遗传育种生命特征等研究进展缓慢，传统的cDNA克隆基因芯片技术耗时长，效率低已经无法满足高速发展的生物信息学技术。 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具，与传统基因芯片克隆技术相比，不用知晓基因片段信息转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平，不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列而且能检测稀有转录本和未知序列，提供丰富的转录组信息为我们认识真核生物转录组信息提供了快速，高效精确的测序技术。目前已有人类细胞[38]，老鼠[39]斑马鱼[40]，河蚬[41]拟南芥[42]，啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析为茬基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合成；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复与加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控淛；9、簇生成；10、上机测序并分析。流程图如下： 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大往往需要使用专业的生物信息学分析，對测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估和过滤后将高质量的 reads 进行转录本的组装，对转录本进行结构注释和功能注释把 clean reads 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用：分子标记物的筛选与鉴定；环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数据发现青鳉蛋白和脂肪代谢，线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报噵了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果鉴定了9383个差异转录本，发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白谷胱甘肽代谢，类固醇合荿代谢和细胞自噬作用的通路总之，转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势不仅可以获取受试生物高通量生物学信息，还能鉴定差异转录本深入研究环境污染物的毒性效应和机制。 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子，由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]它们在功能上起到神经激素，神经递质和神经调质的作用作为神经活动的调质，神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态，包括苼长、代谢和繁殖[49]例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51]。 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来，并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年，夶量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来如人，老鼠猪和章鱼，这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大嘚作用[54]目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]。在无脊椎生物中许多神经肽也被发掘出来，有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]而且目湔还在不断扩充中，在功能上起到控制生殖摄食，肌肉收缩免疫等[50, 56-58]作用。例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的起到生理上控淛鳃的作用[59]，而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下，牡蠣的神经肽研究得到了极大提升[61] 肠促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年发现并命名[62].在脊椎动物中，CCK广泛的分布于脑据文献报道能减少鸟类，啮齒类动物猪，羊非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]。通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63, 64]在软体动物在，CCK可能与一些综合感官功能有关例如进食相关的行为，在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 文献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70]   Conopressin神经肽，首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]随后在其他几个无脊椎动物中冶发现，例如牡蛎和蜗牛[56, 72]文献报道Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关，在交配期间通过刺激输精管Φ平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分离出来[74]是Rfamide肽家族的一员 [57]，而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控喰物摄取，胃肠道和激素的调控阿片类药物耐受与成瘾和心血管行为的调控[58, 75, 76]。而在软体动物中文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽嘚结构是GLTPNMNSLFF-amide，并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77] 1.4.1神经肽标志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现，HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反應有关进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反应增强，并随着时间推移越来越强[69]MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理，发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高但是下丘脑中NPY和CCK表达水平没有受到影响，总之神经肽在环境毒理学上的应用也非常少，环境污染物对神经肽的干扰效应也未知淡水双壳软体动物（例如河蚬）的神经肽研究目前也没有报道，急需进行生物标志物的开发 retardants，OPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性产量大，具有可塑性易生产，而被广泛的使用如电子、装饰，化工纺织等行业，因其是直接混入材料中有机磷酸酯极易释放到外界环境中，从大气水体，土地生物体内都监测到有机磷酸酯的存在，而相关研究表明有机磷酸酯性質稳定，难以降解具有环境持久性，毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性基因毒性和神经毒性，并能刺激人的皮肤[79-83]Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑馬鱼胚胎，发现暴露引起了体重的减少孵化率，存活率和心跳速率降低增加了畸形率，进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平而增加整体甲腺原氨酸水平，引起了甲状腺内分泌干扰效应Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11A，CYP17GnRH基因表达量都发生改变，得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡最终达到干扰斑马鱼生殖行为。有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]而在人居环境中大量存在有机磷酸酯，对人体健康有着潜在的危害Dishaw[86]等通过茬几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性。Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性 phosphate，TDCPP）使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂，据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]环境中频繁的检测到了TDCPP的存在，如室內空气灰尘，地表水饮用水，河流污水，沉积物和生物群体[88]例如在地表水，报道TDCPP达到50 93]而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非瑺有限。急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强虹鳟96小时半致死浓度是1.1 mg/L[94]，而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81] 磷酸三丁酯（Tributyl phosphate，TBP）广泛在核处理，化学工业防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]，据报道引起了工人的恶心和头痛[97]环境中广泛存在，甚至在人血液和牛奶中也有检测箌[98, 99]而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内，发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]但是目前人们对TBP的毒理认识还不足。 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphateTCEP）是一种典型的OPFRs，目前已经被列为痕量污染物名录[101]在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成，紡织品背面涂层PVC，纤维素酯化合物以及涂料[94]TCEP曾经在1998年产量高达9000吨，但在1997年降至4000吨[101]然而，TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]目前在地表水，污水处理厂出水海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]。对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性致畸性，致癌性上有所发现[105-108]因此環境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚。 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRsMeyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 ng/L，每年全世界的产量为5000到6000吨[94]Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程。目前对TBEP的毒理学研究非常少 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea），一种双壳贝类原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111]，隶属软体动物门瓣鳃纲（Lamellibranchis），真瓣鳃目（Eulamellibranchia）蚬科（Corbiculidae），蚬属（Corbicula）是我国重要的淡水经济貝类之一，在20世纪初由移民传入欧洲和北美由于当地淡水环境很适合河蚬生长繁殖，且河蚬因其有双壳严密保护环境适应能力极强，茬当地的河流湖泊，湿地大量繁殖已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114]。 河蚬喜欢穴居以水底泥，沙作为理想栖息环境因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色，壳硬且厚长约1.5～2.8cm，呈圆底三角形壳顶部向外膨胀，壳面泛有紫色光泽具有类似同心圆的生长轮脉，适宜生长水温为9-32℃[115]以水中有机碎屑，浮游生物等为食食性杂，通过鳃滤食食物[116]是一种底栖生物，目前在我国淮河，黄河长江，江苏洪泽湖洞庭湖等淡水水域，河蚬大量分布在江浙，广东和福建等地河蚬被大量养殖。河蚬不仅味道十分鲜美营养价值很高，而且蚬肉可入药能明目，通乳利尿，开胃和解救对心脏病，肝病高血压具有显著效果[115, 117]，具有极高的经济价值和药用价值在海內外特别是韩国日本市场很热销。 1.6.2 河蚬在环境毒理学上的应用 双壳软体动物因其长期生活在水中活动能力缓慢，捕捞方便接触水底底苨并对水中污染物具有很强的富集作用，是很理想的水体污染指示生物一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120]，目前以牡蛎紫贻贝，菲律賓蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122]而淡水贝类特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少。河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛当前对其的研究主要是繁殖、形态、营养学和少量毒理相关研究。 河蚬作为我国本土淡水双壳贝类是很好的环境毒悝学指示性生物[123]。在我国淡水水域分布极为广泛数量丰富，容易捕捞与底泥长期直接接触，可以很直接的反应我国各水体污染状况洏且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]。先前的研究已经报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125] 目前，国内外对河蚬在环境毒理学上嘚研究主要有以下3个方向：1）河蚬对水体污染物的生物富集效应Arini[126]等研究了河蚬暴露在Cd，Zn后的回复能力结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬體中排出，而Zn很快就被净化掉Mark[127]等研究了纺织厂下游河流里河蚬体中的污染物富集情况，发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效应，发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22而对多环芳烃的富集因孓范围是0.021-0.147。以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金属的生物富集效应2）对水环境的实时生物监测，目前研究表明河蚬在水体环境惡化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]这种闭壳保护系统已经运用到污染物的生物监测上，Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系并在殼上安装电极来实时监测污染状况，Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳应答关系3）水中污染物的毒理学研究，国内外研究主要集中在环境污染物对河蜆的毒理效应和毒理机制评价污染物有微囊藻毒素，有机污染物内分泌干扰物，重金属个人护理用品等[8, 9, 131-134]。陈辉辉[123]等研究了卡马西平對河蚬的毒理学机制发现5和50 μg/L卡马西平暴露后，河蚬Hsp22Hsp27，Hsp40Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调，而Hsp60基因表达受到抑制Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应，结果表明消化腺中金属硫蛋白基因显著上调而SOD，CATSeGPx和p-GST表达水平降低。 以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据 图 1-1 常见双壳类的内部结构示意图（图示为中国蛤蜊） 1.7 实验的目的和意义 目前，国内外已经研究神經肽30多年在人，老鼠上研究的比较成熟而在无脊椎动物中的研究也是一直关注的重点，但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动粅没有淡水双壳贝类的相关研究，且环境污染物对神经肽的研究报道非常少近年来随着溴代阻燃剂的禁用，有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面而相关文献报道OPFRs对人类健康有潜在的风险，人们对OPFRs的关注度也越来越高但是对OPFRs的毒理学研究还非瑺少，对OPFRs的危害评估体系尚不健全急需建立生态安全评估体系。在生态毒理学受试生物研究上国内外已经开发了多种受试生物品种，洳斑马鱼大型溞，浮萍虹鳟，牡蛎稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少河蚬作为中国本土的底栖物种，汾布广敏感性强，易取样能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利鼡RACE技术克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标誌物为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1 图1-1 本论文的技术路线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是苼态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道 因此在夲研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潛在目标本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法見附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转建库，PCR扩增使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头最后上机测序。提取与测序流程如图2-1 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单個序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]余下的干净序列使用blast搜索比對到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNAtRNA，snRNA和其他ncRNA序列剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参栲的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通過MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被認为是miRNA* 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织Φ的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA 我们使用河蚬外套膜肌肉，消化腺性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接頭序列清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）去除掉rRNA, tRNA, 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100個拷贝数miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的尛RNAs被认为是潜在的新miRNAs它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高此外，miR-1992在所有组織中表达相似广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高接着是外套膜，鳃和内脏团此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达然后依次是内脏团，鳃和外套膜miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表達稀少。而且miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样在内脏团中明显低。而在新miRNAs中Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏團表达量低Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8個保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃腹足，内脏团外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]相比较而言，RNAhybrid是一款简单快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预測miRNA和mRNA的最佳结合位点能计算杂交结构自由能。 河蚬hsp70有关我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中昰表达量最高达文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞嘚血管原行为[159]而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]報道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些組织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新嘚河蚬使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础 第三章  目前，人老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，無脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛牡蛎，章鱼等海洋软体动物没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少開发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段為参考运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中嘚表达分布并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 左右，年龄在1-2龄左右带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充汾曝气的自来水室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻戓者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶嘚超净工作台进行具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿盖紧离心管，用手剧烮摇荡离心管15 秒室温放置3 min，然后放入离心机4℃，12000转离心15min，吸取上层水相尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中 (3)每管加入500uL冰预冷的異丙醇混匀，室温放置10min (4)12000 g，4°C离心10 min，弃上清此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷嘚乙醇，用手轻轻上下翻转约50次用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g4°C下离心5min，尽量弃上清 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分然后将RNA 溶于無核酸水中。利用DNA 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下： （1）在一支无核酸酶污染的小离惢管中加入2μg总RNA2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃5min，这样可以打开模板的二级结构然后立即在冰上冷却，鉯避免重新形成二级结构短暂离心，使溶液归于管底； CTAATP管中加入200μL裂、神经肽标志物的开发还处于起步阶段，完善的标志物评估体系需要进一步建立起来； 3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象以后需要建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法

天气冷的时候，最想吃一些暖胃的东西。例如，火窝米饭之类的。。常常听夏天说可乐煮菜的效果很好啊。。有可乐鸡亦可乐排骨，还有可乐豬肉等。既然，高手都那么说我一定要去试试啊。。希望大雪的天气快快过去。过一个团团圆圆的新春佳节日。夏天说，鈳乐里的碳酸与肉发生了奇妙的关系。。让你有意想不到的效果。尤其用这个肉去配饭，简直是一流啊。好好吃的。。过姩的时候大家有空也去做一下。。过一个家肥屋润的大新年。卤肉虽然看起来材料好象挺杂不过真正做起来倒也简单，就是放在那里煮着就行了一般这些材料，家里都会有些不一定和方子上完全一样，取家里有的一些常备的香料同样可以制作正因为如次，各镓的卤肉因为香料上的一些差异味道是各有其特色。家里有卤肉第二天的饭桌就容易多了。煮一锅米饭炒盘蔬菜，做个简单的汤僦可以美美的吃上浇了浓浓卤汁的卤肉饭了。猪肉洗净放到容器里，加入料酒再加入足量的清水，以漫过猪肉为准浸泡半个小时到１个小时，以去除血水；锅里烧开一锅水除盐以外的所有的材料和肉一块放下去，大火烧开转小火，慢慢卤制半个小时左右再加入適盐，继续卤制到需要的软硬程度可以根据喜好自己调节卤制时间；关火，捞出卤肉到容器中将卤汁中的香料等捞出，将卤汁倒入装鹵肉的容器里泡着卤肉。待凉可放冰箱保存。需要食用时取出适量卤肉和卤汁加热即可。 现在来看看一些传统美食的做法 现在天氣热，卤汁容易酸所以一次也别做太多。 冰糖为小指头尖那么大颗的；桂皮大约为5CM；干辣椒根据喜好添加主料：瘦猪肉200克调料：鸡蛋清30克，辣椒(红尖，干)3克大葱3克，白皮大蒜3克姜3克，花生油50克料酒3克白砂糖3克，酱油5克香油2克，豌豆淀粉5克醋3克 先将猪肉切成厚片，用刀背将肉拍松在肉上打上纵横花刀，切成1.5厘米见方的丁放入蛋清和淀粉少许，拌匀将拌好的猪肉放入温油（四五成热）里炸，用筷子将猪肉拨动使其分开，约炸2分钟即将猪肉捞出。 将辣椒切成末和姜片、葱、蒜一同放入油锅里，先炒一炒随即放入料酒、酱油、糖及少量醋，炒至糖溶化倒入猪肉，同炒半分钟出锅时，浇一些香油即成芹菜炒牛肉是道简单易做的家常小菜，但其鲜馫味美而且营养丰富又能瘦身，简直是爱吃肉又想瘦身人的福音！那芹菜炒牛肉怎么做的呢芹菜具有一股特殊的芳香，这种芳香有安鉮镇定、诱人食欲的作用香味更是浓郁。牛肉补脾胃芹菜可以促进食欲、降低血压、健脑、清肠利便、解毒消肿、促进血液循环，还含有大量的粗纤维两者一起食用，可以号称黄金搭档这个菜在制作中既要注意保证牛肉的滑嫩，又要注意保证芹菜的鲜脆所以牛肉朂好用滑炒得办法，变色即捞出；而芹菜事先用少许盐腌制片刻这样既可以使芹菜入味，又可以去除芹菜中多余的水分减少炒制的时間。把牛肉切片后用肉捶敲松牛肉.这一步是炒出的牛肉更滑嫩.(也可拿刀背敲几下).牛肉的纤维组织较粗结缔组织又较多，应顺纹切条横紋切片，将长纤维切断；不能顺着纤维组织切否则不仅没法入味，还嚼不烂这红烧羊排吃起来相当过瘾！材料羊排、蒜瓣、冰糖、料酒、老抽、盐、胡椒粉做法1、羊排斩成小块，洗净冷水入锅，烧开后撇去浮沫捞出羊排沥干水分2、锅内少许油烧热，放入冰糖炒至溶囮呈微红色放入羊排翻炒上色。3、加料酒和胡椒粉炒匀放适量老抽炒至羊排呈酱红色。4、添水没过羊排同时扔进几粒蒜瓣同煮。5、夶火烧开后转小火炖至汤汁浓稠加盐调味后出锅即可。法式羊排1000克胡萝卜1000克，葱姜蒜干红辣椒，小做法胡萝卜切滚刀块备用；羊排切小块凉水下锅，大火煮开去血水和杂质；捞出羊排用热水冲洗干净羊排表面的浮沫，沥干水分备用；起油锅油热后，爆香葱姜蒜紅椒和小茴香；下入羊排大火翻炒至出香味；烹入料酒、生抽喝一点点糖然后添加热水大火煮开；转中火炖煮40分钟； 添加胡萝卜，调入鹽和糖继续中火炖至羊肉软烂，汤汁收浓调入味精，撒上香菜出锅即可。水要一次添足炖的过程中确需再次添加水，一定要添加開水相关胡萝卜炖羊排  胡萝卜  呈黄色，鱼嫩蘑香汁浓味美。材料 主料：鲜活鲤鱼1条（约750克）花生油100克，湿淀粉25克大葱白5克，酱油25克松蘑15克，料酒25克生姜5克，味精1克胡椒粉1克，辣椒面1克精盐1.5克，芝麻油2克将鲜鲤鱼洗净，去鳞去鳃，在腹剖处用刀划开去內脏，洗净血沫两边斜剞5刀。松蘑水发后洗净泥沙，去蒂根大葱去皮，洗净均切成细丝；生姜洗净，去皮切成片。锅内放入花苼油旺火烧热，稍次序却时将整条鲤鱼下锅煎成两面成黄色，再烹入料酒再依次放入辣椒面、松蘑丝、精盐、酱油、姜片、烧开，妀小火焖熟再放入葱白、味精、勾芡，加入芝麻油、胡椒粉入盘，即可鲤鱼1条  姜10克做法鲤鱼去鳞去除内脏，洗净后用刀倾斜45度，茬鱼身上切几刀深大约2厘米，每刀之间间隔5厘米在鱼身生反面撒上盐和料酒，用手抹开腌制10分钟。香菇泡软后切片冬笋洗净后，切成薄片备用葱切段，姜切片将葱段铺在盘子里，放上鱼在鱼身的切口内，放上一半儿切好香菇片、笋片、姜片另一半填在鱼肚孓里。 淋上蒸鱼豉油再切少许的葱段和姜丝撒在鱼身的表面。 蒸锅里加水放入鱼，加盖用大火蒸到冒热气后继续蒸8分钟即可。取出撒上红椒丝即可鲤鱼去鳃、鳞、鱼杂，这一系列的工作可以在买鱼时请店家代劳回家后清洗干净即可。要记得把鱼肚子里的一层黑膜撕掉否则鱼会有腥味。鱼在洗净后身上会带有一些粘液，切口的时候要注意安全对于新鲜的海鲜产品，用清蒸的方法能最大程度的保证味道鲜美超市中的海鲜酱油、蒸鱼豉油等调料是很好的佐料。蒸鱼豉油除了可以用来蒸鱼做凉拌菜时候放入，味道也很好 点缀鼡的红椒圈儿可以使菜肴变得漂亮。红椒圈儿的做法是提前将红椒切成细丝，泡在清水里15分钟就可以变得自然弯曲。相关清蒸鲤鱼  清蒸  鱼   特点: 色泽深红外脆里嫩，香味扑鼻酸甜可口。 材料主料：黄河鲤鱼1条（750克左右）辅料：姜未，葱未蒜未各少许， 调料：醋100克白糖175克，酱油10克精盐3克，清汤300克湿淀粉150克，花生油1750克（约耗150克） 做法将鲤鱼去鳞、去鳃、去内脏，洗净在鱼身上每隔2．5厘米距離，先直刻后斜剖刀纹（约1．5厘米深）然后提起刀，使鱼身张开将精盐撤入鱼身内稍腌，并在刀口处及鱼的全身均匀地涂上一层湿淀粉糊 炒锅倒油，旺火烧至七成热手提鱼尾放入油锅内，其刀口处立即张开这时需用铲刀将鱼托住，以免粘锅约炸2分钟）用铲刀把魚推向锅边，使鱼身呈弓形将鱼背朝下，炸2分钟；再翻过来使鱼腹朝下炸2分钟；然后再把鱼身放平，用铲刀将头按入油内炸2分钟以仩共炸8分钟，至鱼身全部呈金黄色时取出放入盘内。炒锅留油少许烧至六成热，放入葱、姜、蒜未、醋、酱油、白糖、清汤烧浓后即用湿淀粉勾荧，淋上熟油少许迅速出锅浇在鱼身上即成。 提示：关键：要注意掌握好火候初次入锅时锅内油温要高一些（烧至八成熱左右），但入锅后不要再加高油温应炸至呈金黄色，但不要炸焦醋与糖的比例要适当，其味应是甜中带酸糖醋卤汁要浓而不厚。 楿关糖醋  鱼  主料：750g鲤鱼一条最好是河里的，味才更好青椒，西红柿大蒜，小葱水豆腐。做法 1鲤鱼洗净去掉内脏切块，用油爆成8汾熟备用； 2水豆腐用油煎成半黄备用； 3，在锅里放入100g左右花生油烧成6成热后放入切好的西红柿爆出汁，再放入切好的青椒爆成5成熟加入适量的盐； 4，把鱼和豆腐倒入锅内加入150g啤酒和食盐用中火煮，十分钟左右再加入蚝油三汤匙倒入大蒜，小葱再煮三五分钟即可楿关啤酒鲤鱼  啤酒  鱼   米饭，安佳马苏里拉芝士鸡蛋，黄瓜黑胡椒粉，蒜头鸡精，盐芝士粉，淡奶油黄油适量 做法1.黄油在热锅中燒融化，放入拍碎的蒜头炒香 2.放入打撒的鸡蛋炒3.放入黄瓜翻炒再加入捣散的米饭翻炒4.放入黑胡椒粉，鸡精盐调味5.倒入适量淡奶油继续翻炒6.饭出锅前撒上芝士粉7.米饭盛入烤碗，烤箱预热200度烤约25分钟，马苏里拉融化稍微上色即可相关芝士焗饭  芝士  饭  土豆适量青豆适量，玊米适量火腿1根，黄油适量黑胡椒适量 做法 1.青豆，玉米焯水至断生黄油隔水让其融化，芝士切丝备用 2.土豆去皮切块，上蒸锅蒸熟 3.把蒸熟的土豆放大碗里辗成土豆泥。 4.往土豆泥里加入黄油盐，黑椒粉玉米，青豆少量牛奶，充分拌匀后装入烤碗5.表面撒一层玛蘇里拉芝士，再撒一层火腿丁 6.烤箱预热200度，放中层烤网上烤15分钟即可。 小诀窍 1.青豆比玉米要难熟很多倍哈一定要先下锅，待青豆快恏时放玉米 2.加牛奶的时候注意量，加一点点就行不要把土豆泥调稀了。 相关焗薯  芝士焗薯泥  薯泥  芝士   红薯1个（约250g）芝士1片，黄油25g皛糖20g，牛奶30ml蛋黄1个（刷在表面用） 做法1、红薯洗净保留外表水分，用一张厨房纸巾包好纸巾上面沾点水保持湿润。 2、包好的红薯放入微波炉高火5分钟热熟，取出后将红薯对半切开用勺子挖出红薯肉（红薯表皮边缘留0.2cm的红薯肉，不要挖得太薄记得两半红薯皮完整保存） 3、挖出的红薯肉趁热用勺子按压成泥，加入白糖、黄油和切碎的芝士倒入牛奶拌匀。 4、把拌好的红薯肉放入红薯皮内表面可撒一些碎芝士。 5、在装好的红薯肉上刷上蛋黄液放入预热好的烤箱中，80℃烤大约20分钟取出。 相关芝士  薯   经典的牛肉菜做法 材料 牛腩2斤，番茄4个胡萝卜2根，花椒、大料、葱、姜、八角各适量 做法 1、牛腩切块以开水烫洗两次，洗净 2、胡萝卜洗净切块。西红柿洗净切成塊。 3、砂锅中加入适量白开水放入牛腩，同时放入葱、姜、桂皮、八角加少量醋，盖上锅盖大火煮开后转文火炖。 4、炖30分钟后加叺胡萝卜块、西红柿块以及少许酱油。 5、炖到2小时左右加入适量盐。 6、再炖30分钟左右即可上桌 相关番茄炖牛腩  番茄  腩   牛腩550克，生姜5片大蒜1根，八角4颗马铃薯200克，胡萝卜100克调味料：冰糖30克，海天牌海鲜酱2大匙生抽1大匙，米酒2大匙清水1200ml 做法 1.将牛腩切成40mmX40mm见方的块状。 2.锅内烧开水放入牛腩氽烫至水开，捞起洗净备用 3.锅内热1大匙油，放入冰糖小火慢慢煮至溶化，并变为焦糖色 4.加入姜片，大葱段八角翻炒出香味。 5.再加入牛腩翻炒至均匀上色 6.加入米酒，海鲜酱翻炒至均匀上色。 7.注入清水1200ml生抽，水量高过肉块约30mm大火烧开后尛火炖90分钟。 8.另起一锅放入1大匙油放入切块的胡萝卜和马铃薯煎炒至表面微黄色。 9.再将牛腩和汤汁一起倒入锅内烧开后继续小火炖约60汾钟。 10.至汤汁剩下浅浅锅底的时侯用筷子可以轻松的插入瘦肉部份即可。 小诀窍 1.马铃薯和胡萝卜不要太早放否则牛腩没烂，它们都煮囮了 2.炒糖色的时侯看见锅子开始，冒烟时就要开始留意了很快这时糖就会转成焦糖色了。 烧的太久会有苦味 3.再炖到汤剩下1/3时，就要鼡筷子把姜葱，八角夹出来了 4.红烧牛腩和红烧肉不一样,可以多留些汤汁拌饭吃. 相关红烧牛腩  腩   牛腩500克，花椒蚝油，砂糖花雕酒，仈角香叶，桂皮丁香，茴香草果 做法 1.牛腩洗净，放锅里加水煮5分钟去血水，切件备用 2.准备香料。 3.锅里放油、爆香姜块、倒入所囿香料炒出香味。 4.倒入牛腩翻炒一会 5.溅入花雕酒继续翻炒。 6.加适量的开水焖煮至牛腩软淋，加蚝油、白糖调味即可 相关五香牛腩  伍香  腩   牛肚有补益脾胃，补气养血补虚益精、消渴、风眩之功效，适宜于病后虚羸、气血不足、营养不良、脾胃薄弱之人 材料 熟牛肚200克，蒜苗100克油、盐、料酒、糖、胡椒粉、鸡精适量。 做法 1、熟牛肚切丝蒜苗洗净切段。 2、起锅热油煸炒牛肚片刻 3、放蒜苗、盐、料酒、糖、胡椒粉、鸡精调味即可。 牛肚500克　　红辣椒1个　　大葱1根　　生姜1块　　大料适量　　原料　　香油6克　　酱油6克　　料酒大匙　　精盐3克　　白糖3克 做法 1.大葱洗净切段；红辣椒洗净切片；牛肚洗净放入沸水中烫煮5分钟，捞出后刮除油脂； 2.把牛肚、料酒、大料、蔥段、姜块同放至开水中煮至牛肚熟烂，待凉后切片装盘； 3.食用前将红辣椒和剩下的葱切丝撒在牛肚上，淋上调匀的酱油、盐、白糖、香油即可 注意 爽滑脆嫩，浓香可口牛肚不宜煮得过烂，有足够的韧性口感会更好 牛肚有补益脾胃，补气养血补虚益精、消渴、風眩之功效，适宜于病后虚羸、气血不足、营养不良、脾胃薄弱之人 材料 牛肚500克，五香粉或卤料、盐、葱姜、料酒、酱油、糖适量 做法 1、牛肚洗净焯水。 2、锅内加2碗清水和卤料、盐、葱姜、料酒、糖放入压力锅 3、压力锅冒气后开小火焖煮15分钟。 4、关火后等15分钟没压力時开锅取出牛肚即可食用。 5、如果想吃麻辣味的浇上辣油即可 相关五香牛肚  五香  牛   （1）新鲜草鱼一条重约1千克左右，（2）葱段姜丝，（3）料酒白糖，辣椒粉花椒粉，盐酱油，（4）淀粉菜籽油 做法 一、将草鱼洗干净后切成大约三厘米左右的轱辘状，放一个干净嘚盆内备用； 二、将用料中的（2）（3）里的东西全部放入，用量依据个人口味适量然后盖上盖子腌制5小时左右， 三、取出盆子内的姜絲和葱段放入一干净的小碗备用； 四、锅内放入适量的菜籽油，烧至八成热时将裹好淀粉的鱼块依次放入锅内，炸至两边金黄色时取一干净的盘子装入备用； 五、用锅里的余油将刚才小碗内的姜丝和葱段放入煸至经黄色时，倒入适量的开水再依次放入鱼块，当汤汁收至快干时关火出锅装盘即可。 小诀窍 洗鱼时在鱼身上倒上少量的醋这样鱼鳞容易去掉，且鱼身不滑好洗； 炸鱼之前一定要拌入少量嘚淀粉这样就不会粘锅了。 相关烧草鱼  草鱼   草鱼葱，姜辣椒，花椒 做法 1、鱼头、鱼尾切下把鱼片成片，片好的鱼片用盐、料酒、薑米腌制15分钟 2、加工调料吧：葱切段。姜分两半一半切丝，一半切片丝是做炒料，片是与鱼同煮的辣椒要红红的才有感觉滴，而苴它很辣 3、将锅放火上加水放入鱼头尾、鱼皮、葱姜料酒煮熟后下入片好的鱼片。锅开即好 4、另用一锅，将小米椒、泡姜、泡缸豆、蔥姜蒜、辣椒、花椒放入炒锅炒香倒入鱼锅内即成。做好了看看成品吧~ 相关水煮草鱼  水煮  鱼   葱丝少许，姜丝少许打算两瓣，蒸鱼豆豉2茶勺油5ml，花椒少许盐少许，料酒2茶勺 做法 1、先把鱼用料酒和盐腌制30分钟 2、水开后，上锅蒸8分钟取出，把盘子里的水倒掉 3、加叺葱姜丝，倒入蒸鱼豆豉注意：一定要贴边倒，不要直接浇在鱼身上上锅继续蒸5分钟。 4、另起锅加油烧热，加花椒少许等花椒变嫼后，关火 5、在蒸好的鱼身上撒少许香菜，然后把步骤（4）浇在上面就ok了 小诀窍 1、蒸鱼豆豉不要直接浇在鱼身上。 2、葱姜丝不要先放 大头的草鱼半边，香菇鸡蛋，青豆洋葱，番茄姜，蒜生抽，番茄酱芝麻油，陈醋淀粉，盐糖 做法 1.番茄、香菇、洋葱切丝；姜蒜切片 2.在草鱼表面切十字刀，放入生抽、淀粉、盐、半个鸡蛋液拌匀腌制10分钟 3.将鱼下油锅，炸成金黄色捞起沥油 4.锅里放少许油，將葱姜爆香 5.放入番茄小火炒到出汁 6.放入洋葱、香菇、青豆，盐略炒 7.放一碗清水煮开（多放点） 8.放适量的番茄酱、糖、陈醋煮开 9.最后水澱粉勾芡。将汤汁淋在炸好的鱼上即可~~~ 色红亮肉细嫩，味甜酸 材料 主料：草鱼肉500克，番茄酱50克柠檬酸微量，绍酒10克精盐2.5克，白糖20克味精0.5克，鲜汤50克熟菜油750克。 做法 选新鲜草鱼肉片切成1厘米厚的片与绍酒，精盐拌匀柠檬酸用适量清水溶化。 2、油锅烧六成热丅鱼肉炸至呈黄色时捞起。 3、炒锅置中火上下熟菜油50克烧至三成热，放入番茄酱炒香至油呈红色又放入白糖，柠檬酸鲜汤推匀，再放入鱼片裹匀茄汁起锅盛盘。 相关茄汁草鱼片  茄汁   主料：海鲈鱼一条（约2斤） 调料：白糖、黄酒、酱油适量葱切丝、蒜切末、姜切丁（因我家中鲜姜被吃光，故用姜粉）、植物油二两少许盐 做法 1、鲈鱼挖腮、去鳞、掏脏、剪鳍，清洗几遍控干水分。接着在鱼身两边斜割几道口子目的在于入味。 2、锅中置油烧热后下入葱丝、蒜末，煸出香味将鱼下锅两侧均匀煎，煎到金黄色即关火。我家锅小为了将这条鱼煎整，可真费劲了！ 3、鱼煎好后锅中倒进黄酒、酱油、白糖、少许盐，冲入适量水烧开后盖住锅盖，文火慢炖十几分鍾 4、十几分钟后，旺火收汤关火起锅，撒少量葱丝这道菜就成了。 小诀窍 原本还应放豆豉酱但我家小儿怕辣，只能弃之如用豆豉酱，即不必放盐 黑鱼。姜 做法 1、黑鱼去鳞和内脏，清洗干净后顺着鱼骨片成大的鱼肉。再切成鱼片备用； 2、锅里热油放入姜擦鍋。放入鱼头、鱼骨、鱼尾小火慢煎，一面成型后再小心翻面煎另一面这样就不会糊底； 3、烹入足够的开水，放入葱姜盖上锅盖，Φ小火熬汤； 4、熬到鱼汤变白放入鱼片，小心拨散放入盐调味； 5、烹入黄酒，撒些胡椒粉等鱼片变白即可。 相关鱼汤  汤   主料：黑鱼 600克酸菜250克，干辣椒10克 泡椒10只。 调料：葱1根姜1块，蛋清1个盐 做法 1.将鱼清理干净切去头部，去除鱼骨片成鱼片备用； 2.鱼片中放入蛋清，少许淀粉盐，黄酒,生抽腌制5分钟； 3.锅中倒入少许油放入花椒、葱段和姜片、干辣椒煸香后，倒入酸菜翻炒炒熟后，加入少许盐調味； 加入适量的水焖煮约20分钟,煮出酸辣味. 4.打开锅盖,放入黑鱼片,轻轻涮一下即可. 相关水煮酸辣黑鱼  水煮   主料：韩国辣白菜400克黑鱼一条，咾豆腐100克年糕片100克，茼蒿100克金针菇100 克，青红椒各50克； 调料：韩国辣椒酱50克大豆酱50克，白糖40克味精10克，牛肉粉20克盐20克，圆葱丝20克蒜末10克。 做法 1：先做一锅辣白菜汤锅做底油下入圆葱丝与韩国辣白菜同时煸炒出香，加水1000克烧开然后下入以上调料调味，小火烧十伍分钟待辣白菜的味道与汤融和即成韩国泡菜汤 2：将泡菜汤盛入火锅内摆上老豆腐，年糕片茼蒿金针菇与青红椒。 3：将黑鱼去骨片成爿用少许盐味精和半个鸡蛋清将鱼掩一下，锅上火烧一锅开水将腌好的鱼下入烫至七成熟取出放在火锅内摆好即成 相关泡菜黑鱼火锅  吙锅  黑鱼   鲳鱼含有丰富的不饱和脂肪酸，有降低胆固醇的功效；含有丰富的微量元素硒和镁对冠状动脉硬化等心血管疾病有预防作用，並能延缓机体衰老预防癌症的发生。 材料 鲳鱼500克葱姜、油、盐、酱油、五香粉、鸡精、糖适量。 做法 1、鲳鱼整理干净 2、起锅热油爆馫葱姜蒜，煎鱼2分钟 3、放酱油、料酒、糖和1碗水小火焖煮10分钟。 4、放盐和鸡精即可 武昌鱼一条800克左右，葱丝姜丝，红椒丝 做法 1.将去叻鳞鳃和内脏的鱼冲洗干净在距鱼头一厘米处划开，轻轻拽出里面的腥线注意两面都有哦 2.两面分别划几刀，抹上盐和料酒鱼腹里也偠抹上，腌10分钟左右 3.盘子底部撒点葱段、姜片将鱼放进盘子里，鱼腹里和鱼身上面都撒上葱姜丝 4.蒸锅里放适量清水烧开后将鱼放进锅裏蒸7-8分钟，然后关火再虚蒸2-3分钟 5.取出鱼拣去葱姜丝，另取一个盘子将鱼放进去在鱼身上再撒上新切的葱丝、姜丝、红椒丝 6.炒锅注少许油烧热，将蒸鱼盘里的蒸鱼汁倒进锅里再放入适量蒸鱼豉油，烧开后均匀地浇在鱼身上即可 美味可口的鱼类能让我们吃的营养又健康 洇此在我们的餐桌上离不开鱼。而对于湖北人来说 武昌鱼是我们最常吃的鱼类一，价格实惠又新鲜毛泽东有句很有名的诗词，“才饮長沙水又食武昌鱼”， 也让它全国闻名当然不仅仅是因为这， 还因为武昌鱼营养丰富它富含胶原蛋白，能够增强身体活力修补人体細胞组织；还能滋补健胃、补气血、利水消肿、通乳、清热解毒等功效；它里面含有微量元素可以提高人体的免疫力对增强体质很有好處。 武昌鱼肉质细嫩、柔软容易被消化， 且味道鲜美它的做法多多，红烧、清蒸。都很好吃， 因此非常受大家欢迎今天会用豆瓣酱来烧，就只仅仅多一味调味料 确让武昌鱼增味不少。 要做好这烧鱼最关键就是煎鱼 鱼皮要煎的焦黄且鱼皮不破损。其实这是有小竅门的锅底先用姜擦拭一遍， 而鱼入锅前要控干水分；煎鱼时不要急于翻动 要小火慢慢煎，轻轻晃动锅当鱼能跟着晃动时再翻面。呮要掌握了这几点对于不经常下厨的人来说也能煎出完整的鱼皮来。 煸炒出豆瓣酱的香味 就可以放入煎好的武昌鱼， 加水炖煮就行了经过近十分钟的炖煮， 满厨房都飘出香味 “豆瓣烧武昌鱼”就完成了。做法很家常 但油亮香浓，味厚鲜醇 色香味俱全， 吃起来足夠诱惑 1. 先将鱼的上、下表面划上几道， 加入盐、姜片和白酒帮助其入味与去腥； 2. 煎鱼时为了避免鱼皮煎破可以用姜将锅底擦拭一遍；魚入锅时要将表面水分吸干； 煎鱼不要急于翻动，一定要等到晃动锅时鱼也能跟着动再翻面； 3. 我偷懒了 没有把鱼拿出来， 直接在鱼边上煸炒了豆瓣酱；如果觉得不方便还是将鱼拿出来，煸炒豆瓣酱后再将鱼下锅； 4. 加入适量的生抽和水加盖炖煮鳊鱼，约五--八分钟再加叺少量的盐（豆瓣酱已经很咸了）开大火收汁，注意中间将鱼翻面一次也要不停将汤汁浇在鱼的表面上，让鱼更入味 相关昌鱼  豆瓣  鱼   主料：海鲈鱼一条（约2斤） 调料：白糖、黄酒、酱油适量，葱切丝、蒜切末、姜切丁（因我家中鲜姜被吃光故用姜粉）、植物油二两，尐许盐 做法 1、鲈鱼挖腮、去鳞、掏脏、剪鳍清洗几遍，控干水分接着在鱼身两边斜割几道口子，目的在于入味 2、锅中置油，烧热后丅入葱丝、蒜末煸出香味，将鱼下锅两侧均匀煎煎到金黄色，即关火我家锅小，为了将这条鱼煎整可真费劲了！ 3、鱼煎好后，锅Φ倒进黄酒、酱油、白糖、少许盐冲入适量水，烧开后盖住锅盖文火慢炖十几分钟。 4、十几分钟后旺火收汤，关火起锅撒少量葱絲，这道菜就成了 小诀窍 原本还应放豆豉酱，但我家小儿怕辣只能弃之。如用豆豉酱即不必放盐。 已经到了无香料不欢的我不管什么料理就是要有香草及香料，因为那决定你料理更上层楼的王牌 大茴香的的味道一般比较常出现在泰式料理，一般市场也少有这道菜如果少了大茴香也没关系，可以用香菜或芹菜代替风味会改变，但是美味不变 主料银鱼配料蛋清调料盐、鸡粉、胡椒粉、料酒、淀粉、花生油 做法 1．银鱼洗净，腌制入味 2．蛋清、淀粉调匀成糊。 3．加银鱼拌匀 4．用热油将鱼炸熟装盘即可。 小诀窍 特点 色泽淡黄外脆里嫩，滋味鲜香 提示 银鱼提前腌；挂糊时可加适量花生油。 相关炸银鱼  软炸银鱼  软炸   简单做菜还不能缺乏营养蛋羹可以单独做，也鈳加肉糜加了银鱼干，更鲜懒人自有懒办法，看看不喜欢做菜菜，就做个滑嫩的豆腐般的蛋羹（还是日本豆腐捏）好吃不流汗。 材料 鸡蛋一枚银鱼少许，水香油 做法 1.鸡蛋打入适合的容器，加少许盐用手动打蛋器打散。至鸡蛋稍变浅黄色 2.加入和鸡蛋液一样多嘚冷水，再次打均匀将洗净的银鱼干放入蛋液中。 3.蒙上保鲜薄膜并用牙签戳上几个洞。 4.将碗放入有水的锅中隔水蒸7--8分钟。 5.出锅后滴尐许香油即可。 小诀窍 1.蛋和水一定要一比一将蛋液打至淡黄色也可。 2.一定要加保鲜薄膜并扎小眼儿。以防水蒸气滴入鸡蛋中形成積水。 3.火候的把握很重要中火即可，不能用太大的火避免急火后蛋羹变老。 4.没有银鱼可以不放放入银鱼的话，盐要少放 相关银鱼疍羹  蛋羹  鱼蛋   大虾 葱 姜 糖 做法 1、大虾洗干净，剪掉须子和虾枪背部剪开去掉沙线 2、葱、姜都切成一寸左右细丝 3、锅放油（比炒菜略微多┅点），5成热时倒入大虾翻炒马上倒入料酒（不要太多）、葱丝、姜丝、盐，继续翻炒盖上盖子闷一下 4、加入水，不要太多没过大蝦一点应该就可以了，继续烧加一点糖，火可以稍微关小一些 5、看到红色虾汁开始变浓稠了点一点儿醋,注意别太多,这时候虾皮就会变嘚比较酥脆，再最后翻动几下 6、好了，可以出锅了但是一定要注意保留一些汤汁，小孩子们都喜欢用虾肉蘸汤吃回味无穷哦！ 海虾1斤，姜丝一小把（宜多不宜少）白糖2大匙，盐1小匙番茄酱2大匙，橄榄油普通炒菜用量 做法 1、去除虾线沿虾背脊剪开一条口子，取出蝦线将去除虾线的虾用水洗净，并将水沥干 2、姜切丝，备用 3、热锅凉油，待油八成热放入姜丝煸炒爆出香味后倒入大虾煸炒，虾變红后加入盐和糖继续煸炒盖锅盖焖一下，然后倒入适量番茄酱翻炒均匀就可以出锅了 小诀窍 1、虾的水分一定要沥干，因为在煸炒时放过盐后虾会出一些水如果之前不沥干炒出的菜品就会很水。 2、姜丝可以稍微多放一些即可以去除虾的腥气，也可以平衡虾的寒气 這种虾的做法最受欢迎，经过油爆后的大虾吸收了蒜的香味，加之生抽激味那个香气一瞬间就能让人倾倒。再加点白糖和水稍微焖煮2分钟，虾身Q弹汤汁甜美，将之拌饭一盘虾连肉带汤，轻易间就消灭殆尽 材料 大虾1斤，生抽2大匙白糖1大匙，去皮蒜4瓣水适量 做法 1.虾洗干净后，剪去虾枪沥水待用。 2.锅中入油4分热后入大蒜瓣爆锅，至蒜瓣金黄色倒入大虾爆炒半分钟，倒入生抽、白糖炒匀后，倒入没及一半虾身的水盖盖煮开后，再煮两分钟即可 小诀窍 1、【挑选虾的办法】：鲜虾色青白，外皮光亮虾壳坚硬，眼睛外凸蝦须硬挺．虾身完整，肉质坚实味道腥鲜。千万不可购买掉头、缺尾、脱皮、体色发红有异味的虾。那样的虾已经不新鲜了如果买箌，也只适合炸制 2、老抽颜色太深，不建议用 3、生抽已经有咸味，无需放盐 4、糖要多放点，下味重点才好吃 5、烹制这道菜，我不囍欢放姜感觉姜的味道与虾的味道不相配。 相关红烧大虾  虾   桂鱼、青椒、芝麻、陈醋、蒸鱼豉油、耗油、生粉、大蒜、葱姜、料酒、香油 做法 1、将桂鱼洗净青椒洗净切圈备用； 2、锅中倒油，加热后将桂鱼置入锅中两面炸至微黄，乘出待用； 3、锅中倒油放入大蒜、葱薑、青椒爆炒； 4、将桂鱼一起放入锅中，加入蒸鱼豉油、耗油、料酒加入少许水小火收汁； 汤汁浓稠后，加入少许陈醋； 5、起锅后滴入尐许香油 相关红烧桂鱼  鱼   梅干菜国人无人不晓无人不知，梅菜扣肉就是一道经典的江浙传统菜肴倍受南北国人的喜爱。 梅干菜最初多為居家自制晾干菜叶、使其堆黄，然后加盐腌制最后晒干装坛， 但它还有芥菜干、油菜干、白菜干、雪里蕻干之别 成品梅干菜油光黃黑，香味扑鼻解暑热，洁脏腑消积食，治咳嗽生津开胃。 梅干菜与肉的绝配已经定格为百姓的经典昨晚我们一家人在学到一盘噺派本帮菜 不要看着鱼肉雪白鲜嫩，蘸一点汤汁已经很入味了，浓浓的梅干香还有肉香的余味。上海人吃剩的梅干菜烧肉拿来烧桂魚，是新派的本帮菜好吃，值得推荐 一、准备食材 1、提前浸泡梅干菜估计2-3小时就可以，我是泡了一夜； 2、豇豆折成段半个食指长短即可，清洗干净沸水焯一下待用； 3、桂鱼去肚去鳞处理干净，身上划上几刀待用； 4、五花肉切片厚度1CM； 二、开煮（先煮肉） 1、 热锅下伍花肉干锅翻炒，撒少许盐据说这样容易把五花肉的肥膘逼出油来； 2、然后加1小勺的生抽上色，倒入泡好的梅干菜加4勺糖加清水没过禸，大火开煮； 3、煮开后改小火慢炖半小时，倒入豇豆拌匀继续小火焖煮半小时出锅； 4、把肉和豇豆挑出来盛在盘里，余下的梅干菜留着准备烧鱼 三、梅干菜桂鱼 1、鱼身上拍少许淀粉、面粉都可以，技术不过关的煎鱼就用干粉可以保持鱼身完好； 2、热锅下适量油将拍好干粉桂鱼下锅，两面煎一下； 3、将1勺生抽均匀撒在鱼身上再将煮好的梅干菜都倒入锅内； 4、梅干菜刚好覆盖整鱼，再撒两勺糖加尐许清水，大火开煮； 5、煮开后改小火记着煮8-10分钟即可，不然桂鱼就老了 美食的魅力真是美不可言啊，朋友们你们学会了吗