PDA培养基不凝固。同一锅，只要加磷酸二氢钾就不凝固。急啊…………昨天做加富不凝固，很纳闷，晚上敢时间继续做了几个对比，今天还是不凝固。不灭菌前都凝固，灭完菌后加磷酸二氢钾的不凝固，其余都凝固。怎么办…………哪位大侠帮帮我感激不尽。
画画釞咹牱箎
测一下PH值，看看是不是PH值低的原因，凝固的，不凝固的，加磷酸二氢钾前后的，都测看看。
磷酸二氢钾要在灭完菌后才能加，否则酸性太强会使琼脂降解，把培养基和磷酸二氢钾液分开灭菌，灭完在超净台上加在一起就好了。
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扫描下载二维码培养基为什么要倒置在做实验的时候,当培养基凝固后为什么要将培养皿倒置?
上面说的是其一,补充一下～倒置可是培养基内生长的微生物代谢产生的水能流下来,不会常时间淤积 而影响其呼吸.高中时我是生物课代表,仿佛又回到了两年前啊.
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扫描下载二维码ANTI-MOUSE STK40 POLYCLONAL ANTIBODY AND PREPARATION THEREOF
WIPO Patent Application WO/
The present invention provides an antigen used for preparing an anti-mouse Stk40 polyclonal antibody or a fusion protein and coding sequence thereof, a composition containing the antigen or a fusion protein thereof for immunization, a method for preparing the anti-mouse Stk40 polyclonal antibody, and the anti-mouse Stk40 polyclonal antibody prepared by the method and the use thereof.
Inventors:
JIN, Ying (320 Yue Yang Road, Shanghai 1, 200031, CN)
金颖 (中国上海市岳阳路320号, Shanghai 1, 200031, CN)
Application Number:
Publication Date:
02/14/2013
Filing Date:
08/08/2011
Export Citation:
SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES (320 Yue Yang Road, Shanghai 1, 200031, CN)
中国科学院上海生命科学研究院 (中国上海市岳阳路320号, Shanghai 1, 200031, CN)
JIN, Ying (320 Yue Yang Road, Shanghai 1, 200031, CN)
International Classes:
C07K14/47; C07K16/06; C07K16/18; C07K19/00; C12N15/12; C12N15/63
View Patent Images:
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Foreign References:
CNACN1600788A
Other References:
HUANG, J. ET AL.: 'Identification of a novel serine/threonine kinase that inhibits TNF-induced NF- K B activation and p53-induced transcription.' BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS. vol. 309, no. 4, 03 October 2003, pages 774 - 778
LI, L. ET AL.: 'Stk40 links the pluripotency factor Oct4 to the Erk/MAPK pathway and controls extraembryonic endoderm differentiation.' PNAS vol. 107, no. 4, 26 January 2010, pages 1402 - 1407
Attorney, Agent or Firm:
SHANGHAI PATENT & TRADEMARK LAW OFFICE, LLC (435 Guiping Road, Shanghai 3, 200233, CN)
权 利 要 求 书
1. 一种分离的多肽， 其特征在于， 该多肽的氨基酸序列由 SEQ ID NO: 1 第 340— 430位氨基酸残基之间长 60— 85个氨基酸的氨基酸片段组成。
2. 如权利要求 1 所述的分离的多肽， 其特征在于， 所述多肽的氨基酸由 SEQ ID NO: 1第 349— 420位氨基酸组成。
3. 一种分离的多肽， 其特征在于， 所述多肽由 SEQ ID NO: 1第 340— 430 位氨基酸残基之间长 60— 85 个氨基酸的氨基酸片段与用于促进纯化的多肽组 成。
4. 如权利要求 3 所述的多肽， 其特征在于， 所述用于促进纯化的多肽为 GST或 His。
5. —种用于免疫的组合物， 其特征在于， 该组合物含有权利要求 1 4中 任一项所述的分离的多肽。
6. 一种制备抗小鼠 Stk40的多克隆抗体的方法， 其特征在于， 所述方法包 括使用权利要求 1 4 中任一项所述的分离的多肽或权利要求 5 中任一项所述 的组合物免疫哺乳动物。
7. 如权利要求 6所述的方法，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4或 5所示。
8. 如权利要求 6— 7中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法包括： ( 1 ) 构建含有所述多肽的抗原表达载体；
(2 ) 使用该表达载体转化大肠杆菌；
( 3 ) 纯化所述多肽；
(4 ) 使用所述多肽或含有所述多肽的组合物免疫哺乳动物； 和
( 5 ) 从所述哺乳动物血清中纯化抗体， 从而制得所述抗体。
9. 采用权利要求 6 8 中任一项权利要求所述的方法制备得到的抗小鼠 Stk40多克隆抗体。
10. 一种分离的多核苷酸序列， 其特征在于， 该多核苷酸序列编码权利要 求 1 4中任一项所述的多肽。
Description:
抗小鼠 Stk40的多克隆抗体及其制备 技术领域
本申请涉及抗小鼠 Stk40的多克隆抗体及其制备。 背景技术
Stk40是一个具有丝氨酸 /苏氨酸激酶结构域的蛋白，它在进化上高度保守， 尤其是在哺乳动物之间具有超过 94%以上的同源性 （见下表） 。 Stk40在未分 化的小鼠 ES细胞中的表达量很低， 但是其 RNA (图 1B左） 和蛋白水平 （图 1B右）都随小鼠 ES细胞的分化和类胚体（embryoid bodies, EBs ) 的形成而逐 渐上升。 尤为重要的是， 在小鼠 ES细胞中过表达 Stk40时， 小鼠 ES细胞会出 现分化细胞的形态 （图 1C ) 以及胚外内胚层细胞标志基因的表达 （图 1D ) 。
生物体 名称 登录号 同一性％/比对区域
Mus musculus Stk40 sp|Q7TNL3|STK40— MOUSE 100% / 435aa Rattus norvegicus Stk40 sp|Q7TNL4|STK40_RAT 99% 1 435aa Homo sapiens STK40 sp|Q8N2l9.2|STK40_HUMAN 97% 1435aa Bos taurus STK40 sp|Q17QV9|STK40_BOVIN 94% 1 436aa Gaiius gallus STK40 s p| Q7T0B11 STK40—C HICK 88% 1 435aa Xenopus laevis stk40 sp|Q7T0B0|STK40_XENLA 85% / 433aa 已有文献报道， Stk40是一个直接受 Oct4负调控的下游基因。 当把过表达 Stk40 并标记有 H2B-GFP融合蛋白的小鼠 ES细胞注射到小鼠 3.5天 ( embryo day 3.5， E3.5 ) 囊胚中进行体内的嵌合胚胎实验时， 发现这些细胞绝大多数分 布到了胚胎的 ExEn区域 （图 2 ) 。 这与 Oct4表达下调的细胞在嵌合胚胎实验 中的定位是一致的， 进一步在功能上支持了 Oct4与 Stk40的上下游调控关系。
Stk40作为受 Oct4抑制的新靶基因， 在 ES细胞向胚外内胚层细胞分化过 程中发挥着重要功能。 通过试用多种信号转导通路抑制剂的方法， 发现 Stk40 是通过激活 Ras-Erk/MAPK通路来引起 ES细胞向 ExEn方向分化的。进一步通 过亲和层析、 质谱分析的策略， 找到了一个能与 Stk40直接相互作用的钙结合 蛋白 Rcn2， 并且最近有研究报道 Rcn2高表达于 ExEn细胞中。有趣的是， Rcn2 在小鼠 ES细胞中过表达也能引起与 Stk40过表达类似的分化表型， 并且 Rcn2 对于 Stk40引起的 ExEn方向的分化是必需的。 此外， 已有文献证明 Rcn2能够 与 Ras-Erk/MAPK信号通路中一个重要的支架蛋白 Ksrl形成蛋白复合体，提示 Rcn2有可能通过激活 Ksrl参与 Ras-Erk/MAPK信号通路的调控 （图 3 ) 。
此外， Stk40 基因在小鼠多个重要脏器中表达， 且该基因与它在人类中的 同源基因 STK40具有高度保守性，暗示它可能与人类的疾病和健康有着重要的 联系。
抗小鼠 Stk40多克隆抗体为研究 Stk40在小鼠胚胎发育过程中以及在各个 系统 （如免疫系统） 中的功能和机制提供了便利， 并为研究人类疾病的发生发 展过程中涉及的分子机制研究提供了可能。 目前市场上虽然有一些商品化的抗 Stk40抗体， 但是这些抗体的效果均不能达到 Western blotting应用的要求。 为 此，本发明提供了一种新的抗小鼠 Stk40抗体，该抗体能够满足 Western blotting 应用的要求， 从而解决了本领域所存在的问题。 发明内容
本申请第一方面提供一种分离的多肽，该多肽的氨基酸序列由 SEQ ID NO: 1第 340— 430位氨基酸残基之间长 60— 85个氨基酸的氨基酸片段组成。
在一个具体实施例中， 所述多肽的氨基酸由 SEQ ID NO: 1第 345— 425位 之间的长 63— 75个氨基酸的氨基酸片段组成。
在一个具体实施例中， 所述多肽的氨基酸由 SEQ ID NO: 1第 349— 420位 氨基酸组成。
本申请第二方面提供一种分离的多肽， 所述多肽由 SEQ ID NO: 1第 340 一 430位氨基酸残基之间长 60— 85个氨基酸的氨基酸片段与用于促进纯化的多 肽组成。
在一个具体实施例中， 所述用于促进纯化的多肽为 GST或 His。
在一个具体实施例中， 所述氨基酸片段由 SEQ ID NO: 1第 345— 425位之 间的长 63— 75个氨基酸的氨基酸片段组成。
在另一个具体实施例中， 所述氨基酸片段由 SEQ ID NO: 1第 349— 420位 氨基酸组成。
在一个具体实施例中， 所述多肽的序列如 SEQIDNO: 5所示。
本申请另一方面提供一种用于免疫的组合物， 该组合物含有本申请所述的 分离的多肽。
在一个具体实施例中， 所述分离的多肽由 SEQIDNO: 1第 340— 430位氨 基酸残基之间长 60— 85个氨基酸的氨基酸片段组成。
在另一个具体实施例中， 所述多肽由 SEQIDNO: 1第 340— 430位氨基酸 残基之间长 60— 85个氨基酸的氨基酸片段与用于促进纯化的多肽组成。
在一个具体实施例中， 所述氨基酸片段由 SEQIDNO: 1第 345— 425位之 间的长 63— 75个氨基酸的氨基酸片段组成。
在另一个具体实施例中， 所述氨基酸片段由 SEQIDNO: 1第 349— 420位 氨基酸组成。
在另一具体实施例中， 所述分离的多肽如 SEQIDNO: 5所示。
本申请再一方面提供一种制备抗小鼠 Stk40的多克隆抗体的方法， 其特征 在于， 所述方法包括使用本申请的分离的多肽或其组合物免疫哺乳动物。
在一个具体实施例中， 所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4或 5所示。 在一个具体实施例中， 所述方法包括：
(1) 构建含有所述多肽的抗原表达载体；
(2) 使用该表达载体转化大肠杆菌；
(3) 纯化所述多肽；
(4) 使用所述多肽或含有所述多肽的组合物免疫哺乳动物； 和
(5) 从所述哺乳动物血清中纯化抗体， 从而制得所述抗体。
本申请另一方面涉及采用权利要求 6— 8 中任一项权利要求所述的方法制 备得到的抗小鼠 Stk40多克隆抗体。
本申请还涉及本申请分离的多肽或其组合物在制备抗小鼠 Stk40的多克隆 抗体中的用途。
本申请还涉及一种分离的多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码本申请所述 的分离的多肽。 附图说明
图 1A显示 Stk40的结构示意图； 图 1B显示 Stk40在未分化的小鼠 ES细 胞中的表达量很低， 但是其 RNA (图 1B左） 和蛋白水平 （图 1B右） 都随小 鼠 ES细胞的分化和类胚体的形成而逐渐上升； 图 1C显示， 在小鼠 ES细胞中 过表达 Stk40时， 小鼠 ES细胞会出现分化细胞的形态； 图 1D则显示胚外内胚 层细胞标志基因的表达。
图 2显示当把过表达 Stk40 并标记有 H2B-GFP融合蛋白的小鼠 ES细胞注 射到小鼠 3.5天囊胚中进行体内的嵌合胚胎实验时， 发现这些细胞绝大多数分 布到了胚胎的 ExEn区域。
图 3显示 Stk40作用机制的模式图。
图 4显示 WB检测本申请抗小鼠 Stk40多克隆抗体的结果。
图 5显示 WB检测 Stk40的 C端 98个氨基酸（C98 )作为抗原段制备的抗 体 ( Stk40-C98 ) 的结果。
图 6显示小鼠 Stk40的抗原性指数图谱。 从图中可以看出， 大约在 Stk40 氨基酸序列（SEQ ID NO: 1 )第 349— 375位氨基酸残基和 SEQ ID NO: 1第 386 -424位氨基酸残基处具有较强的免疫原性。 具体实施方式
本申请中， 术语 "多肽"和 "蛋白质" 指氨基酸残基的聚合物， 并不限于 产物的最小长度。 因此， 肽、 寡肽、 二聚物、 多聚物等都包括在该定义中。 全 长的蛋白质及其片段包括在该定义中。 该术语还包括多肽的表达后修饰， 例如 糖基化、 乙酰化、 磷酸化等。 另外， 为了本发明的目的， "多肽 " 指包括天然 序列的修饰， 例如缺失、 添加和取代 (通常性质保守)， 只要蛋白质维持所需活 性。 这些修饰可以通过定点诱变设计， 或可以是偶然的， 例如通过产生蛋白质 的宿主突变， 或由于 PCR扩增引起的错误。
本申请包括多肽的类似物， 所述类似物优选包括性质上保守的取代， 即这 些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。 具体而言， 氨基酸一般被分 成四类： （1) 酸性 天冬氨酸和谷氨酸； （2) 碱性 赖氨酸、 精氨酸、 组氨 酸； （3) 非极性 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 甲硫氨酸、 色氨酸； （4) 无电荷的极性 甘氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 半 胱氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸。 有时将苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸归为芳 族氨基酸。 例如， 有理由预测： 单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、 用谷氨 酸取代天冬氨酸、 用丝氨酸取代苏氨酸， 或者用结构上相关的氨基酸取代类似 的保守的氨基酸， 这样的取代将不会对生物活性有重要影响。 例如， 感兴趣的 多肽可包括多达约 5-10个保守的或不保守的氨基酸取代， 例如， 有 1 8个、 1 5个、 1 3个保守或不保守的氨基酸取代， 只要该分子的所需功能仍维持完 整。 本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的 Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle 曲线图， 容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。 本申请也包括在本申 请多肽中存在 1个或几个 （例如 1、 2、 3、 4、 5或 6或更多个） 氨基酸缺少或 插入。
本申请中， 术语 "片段"指仅由完整的全长多肽序列和结构的一部分组成 的多肽。 因此， 本文所述的 " SEQ ID NO: 1第 345— 425位之间的长 63— 75个 氨基酸的氨基酸片段" 意指 SEQ ID NO: 1第 345— 425位氨基酸序列的一部分 (即此氨基酸序列的一个 "片段" ） ， 该部分长度为 63-75个氨基酸。
本申请中， 当涉及一种多肽或多核苷酸时， "分离"意味着所述的分子从 发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开， 或基本不存在其它相同类型 的生物大分子。
本申请中， "含有"、 "包含 "等类似术语包括了 "由……组成"、 "由…… 构成" 。
本申请中， "表达盒" 、 "表达构建物" 、 或 "表达载体"指能指导感兴 趣的序列或基因的表达的装配。 该表达盒包括上述控制元件， 如操作性连接于 感兴趣的序列或基因（以指导其转录)的启动子， 该表达盒还常常包括多腺苷酸 化序列。构建表达载体，使具体的编码序列位于该具有适合调节序列的载体中， 与控制序列有关的编码序列的位置和取向使编码序列在控制序列的 "控制"下 转录 (； gP， 结合于控制序列中 DNA分子的 RNA聚合酶转录该编码序列；)。 可能 需要对编码感兴趣分子的序列进行修饰来实现此目的。 例如， 在一些情况中可 能需要修饰该序列， 从而使其连接于适合取向的控制序列， 即维持读框。 在插 入到载体之前， 控制序列和其它调节序列可能连接于编码序列。 或者， 可以将 编码序列直接克隆入已包含控制序列和合适的限制酶切位点的表达载体中。 "转化"在本文中指将外源多核苷酸插入宿主细胞中， 而不考虑插入的方 法： 例如， 通过直接摄取、 转染、 感染等的转化。 下文进一步描述具体的转染 方法。 该外源多核苷酸可维持为未整合的载体， 例如附加体， 或者可以被整合 到宿主基因组中。
"宿主细胞" 是已被转化的细胞， 或者能被外源 DNA序列转化的细胞。 本申请第一方面提供一种分离的多肽，该多肽的氨基酸序列由 SEQ ID NO: 1第 340— 430位氨基酸残基之间长 60— 85个氨基酸的氨基酸片段组成。 SEQ ID NO: 1显示了小鼠 Stk40蛋白的氨基酸序列。
该氨基酸片段长度为 63— 80个氨基酸、 63— 75个氨基酸、 70— 75个氨基 酸、 72— 75个氨基酸。 优选的氨基酸片段如 SEQ ID NO: 4所示。
此外， 优选的是， 所述分离的多肽是含有 SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序 列、且其长度在 72— 78个氨基酸之间的 SEQ ID NO: 1第 340— 430位氨基酸残 基之间的氨基酸片段。
在其它优选的实施例中， 所述氨基酸片段优选含有 SEQ ID NO: 1第 349 一 375位氨基酸残基。在其它优选的实施例中，所述氨基酸片段优选含有 SEQ ID NO: 1第 386— 423位氨基酸残基。
该分离的多肽可具有 1个或几个氨基酸突变， 包括 1、 2、 3、 4、 5、 6或 更多个氨基酸插入、 缺少和突变， 只要这些突变并没有改变该分离的多肽的免 疫原性即可。
本申请也包括所述分离的多肽的融合蛋白， 其中， 所述分离的多肽与用于 促进纯化的多肽融合。 所述促进纯化的多肽包括 GST和 His。 GST是一个标签 蛋白， 它能与谷胱甘肽相结合。 因此将本申请的多肽与它融合后， 就能通过融 合蛋白上的 GST与固相化在载体上的谷胱甘肽亲和结合，再利用谷胱甘肽交换 洗脱的原理来纯化融合蛋白。 His标签蛋白的序列即为 6个连续的组氨酸。 通 常 His标签蛋白的表达载体是 PET-30a (该载体购自 Novagen公司） 。 应理解， 用于与本申请的免疫原性多肽融合的多肽， 例如 GST和 His等， 不应削弱或影 响到本申请免疫原性多肽的免疫原性。 本申请也提供本申请多肽， 包括融合蛋白， 的编码序列， 以及含有所述编 码序列的表达载体。
本申请还提供一种用于免疫哺乳动物的组合物， 该组合物含有本申请的多 肽或融合蛋白、 药学上可接受的载体和 /或佐剂。
术语 "佐剂"指辅助或调节药物作用的任何物质， 包括但不仅限于免疫学 佐剂， 它使对抗原的免疫反应增强。 载体通常包括
"药学上可接受的" 指载体可与本申请的多肽和融合蛋白一起给予个体， 而不会在个体体内引起不理想的生物反应， 或与组合物中含有的任何其它成分 进行有害的相互作用。 可使用的载体如水、 盐水、 甘油、 聚乙二醇、 透明质酸、 乙醇等。
组合物中多肽或融合蛋白的量依实际的情况而定， 这在本领域技术人员所 掌握的知识范围之内。 例如， 组合物中多肽或融合蛋白的含量为 0.001— 50重 量％、 0.001— 20重量％、 0.001— 10重量％、 0.001— 1重量％不等。
本申请提供一种制备抗小鼠 Stk40的多克隆抗体的方法， 该方法包括使用 本申请所述的多肽或其融合蛋白免疫哺乳动物。
更具体而言， 本发明的制备方法包括构建含有所述多肽的抗原表达载体的 步骤， 转化、 诱导表达、 纯化以获得抗原的步骤， 免疫步骤， 以及纯化抗体的 步骤。
可采用本领域熟知的方法制备本发明的抗原。 例如， 可构建该抗原的表达 载体， 然后用该表达载体转化宿主细胞， 使宿主细胞表达该抗原， 并从该宿主 细胞培养物中分离、 纯化出抗原。
对于表达载体的选择并无特殊限制， 只要其能够在宿主细胞中表达出本发 明的抗原即可。 通常， 可根据实际所使用的用于促进纯化的多肽来选择适当的 表达载体。 例如， 当使用 GST融合时， 可选择使用 PGEX-4T-1载体。 当选用 His进行融合时， 可选择使用 PET-30a载体。 对于用于促进纯化的多肽的选择 及其对应的表达载体的选择都在本领域所掌握的知识范围之内。
宿主细胞通常为大肠杆菌。 优选地， 根据不同的蛋白表达载体选用不同的 菌种， 并培养于不同的培养基中。 在优选的实施方式中， 表达 GST融合蛋白的 PGEX-4T-1 载体对应于 BL21 菌株和 YTA 培养基， 而表达 His 融合蛋白的 PET-30a载体对应于 BL21-DE3菌株和 LB培养基。
对大肠杆菌的培育并无特殊限制， 可采用现有的常规培养方法进行。
可将纯化所得的抗原免疫哺乳动物。 可采用常规的方法进行免疫。 在一个 具体实施例中， 使用抗原分别注射两只成年雄性兔子， 分两次进行免疫， 两次 之间间隔 1-2个月左右， 总共用 5mg的抗原。 第二次免疫结束后对兔子血清中 抗体的效价进行 ELISA检测， 大于 250万即可将兔子放血， 收集血清， 用于纯 化抗体。
可采用本领域常规的方法来收集血清、 纯化抗体。
本申请也包括采用上述方法制备得到的 Stk40多克隆抗体， 含有该抗体的 组合物， 以及该多克隆抗体或其组合物在研究 Stk40在小鼠胚胎发育过程中以 及在各个系统 （如免疫系统） 中的功能和机制中的用途。 下文将以具体实施例的方式详细描述本发明。 本发明的实施除非另外说 明， 将使用本领域技术人员已知的化学、 生物化学、 重组 DNA技术和免疫学 的常规方法。 这些技术在文献中有完整的解释。 参见， 如 《基础免疫学》 ( Fundamental Virology) ， 第二版， 第 I和 II卷 (B.N.Fields和 D.M.Knipe编）； 《实验免疫学手册》 （Handbook of Experimental Immunology ) ，第 I-IV 卷 (D.M.Weir 禾卩 C.C.Blackwell 编， Blackwell Scientific Publications)； T.E. Creighton , 《蛋白质： 结构和分子特性》 （Proteins: Structures and Molecular properties)(W.H. Freeman and Company, 1993)； A.L. Lehninger, 《生物化学》 ( Biochemistry) (Worth Publishers, Inc.最新版）； Sambrook等， 《分子克隆： 实验室手册》 （Molecular Cloning: a Laboratory Manual ) ,第二版， 1989; 《酶 学方法》 ( Methods in Engymology)(S.Colowick禾卩 N. Kaplan编， Academic Press , Inc.)。
应理解， 本申请并不限于这些具体的实施方式。 本领域技术人员在不偏离 本申请的精神和范围的情况下， 可对本发明作出适当的改动。 在没有明示的情 况下， 所使用的试剂及其用量单位都是本领域常规的。 实施例 1 : 抗原表达载体的构建 Stk40-C72抗原为编码 Stk40 的 C端第 349-420位共 72个氨基酸，其序列 SEQ ID NO: 4所示。
Stk40-C72抗原表达载体构建流程为：
1.设计引进限制性酶切位点的克隆引物：
C72-F ( BamH I) ： 5 ' TTG GGA TCC ATG CCG GAC ATT GAT GAC 3 ' ( SEQ ID NO: 2 )
C72-RC Xho I )： 5， TGT CTC GAG ACT ACA TTG GCT GTG CGT 3 ' ( SEQ ID NO: 3 )
2.以 Flag-LYK4/ppyCAGIP质粒（ Lingjie Li*、 Lei Sun*,等， Stk40 Links the Pluripotency Factor Oct4 to the Erk/MAPK Pathway and Controls Extraembryonic Endoderm Differentiation PNAS. 2010 J 107(4): )为模板， 用 C72-F (BamH I)和 C72-R (Xho I)引物进行 PCR得到 210bp目的片段； 〔注： LYK4 即 Stk40〕
3.用 BamH I和 Xho I酶切 PCR产物， 并进行胶回收， 同时用 BamH I和 Xho I酶切 pGEX-4T-l质粒 （购自 Amersham Biosciences) ， 并跑胶回收 5Kb 载体片段；
4.连接插入片段与载体片段， 4°C过夜；
5.将连接产物转化至大肠杆菌 DH5 a中；
6.挑菌， 小抽酶切鉴定， 取正确的 LYK4-C72/pGEX-4T-l克隆进行测序。 实施例 2: 抗原纯化
1.将实施例 1制备得到的 LYK4-C72/pGEX-4T-l质粒转化至 BL21感受态 中；
2.挑菌到 5ml YTA (蛋白胨 16g/L; 酵母提取物 10g/L; 氯化钠 5 g/L) 中 小摇过夜；
3. 1 : 30接种 2L YTA摇 3h; 30 °C 0.2mM(GST) 或 1 mM(His) IPTG诱导 3h;
4. 10000g， 3min 离心收菌， 分 4管装， 分别用 15ml PBS ( GST)重悬， 1 : 100加入 PMSF (终浓度 ImM) ； 5.超声， 强度： 10-12; 时间： 8-10 间隔： 2s;
6.超声后加入 l%TritonX-100， 离心 10000g， 10min， 取上清；
7.离心期间处理 GST beads: 洗 3次， 10倍体积 PBS， 500g， 5 (存 储： 80%)
将离心后的菌液上清与处理后的 GST beads (每 ml可结合 5-10mg蛋白） 混匀， 4°C， 旋转结合 2-4h;
8. 洗涤： 用 10倍体积 PBS洗 3次， 每次 RT转动 5-10min， 离心； 9. 洗脱； 洗脱缓冲液： 0.1M Tris-cl, 0.2M Nacl, 61.5ng Glutathine, 0.1% TritonX-100; 4°C转动 30min-lh， 离心； 洗脱 2-3次；
10. 跑胶， 考马斯亮蓝染色定量。
此实施例获得 SEQ ID NO: 4与 GST的融合蛋白， 其序列如 SEQ ID NO: 5 所示。 实施例 3 : 免疫兔子
免疫兔子的工作是由上海中科英沐生物科技有限公司完成。 大致流程如 下： 将实施例 2制备得到的 GST融合蛋白抗原分别注射两只成年雄性兔子， 分 两次进行免疫， 两次之间间隔 1-2个月左右， 总共用 5mg的实施例 2制备得到 的 GST融合蛋白抗原。第二次免疫结束后对兔子血清中抗体的效价进行 ELISA 检测， 大于 250万即可将兔子放血， 收集血清， 用于纯化抗体。 实施例 4: 抗体纯化
1 ) 取实施例 3免疫的兔子的兔血清： 该兔子经实施例 2制备得到的 GST 融合蛋白 （溶于 PBS中） 免疫 3次 （约 2个月） ， 取血 （70-90ml/只） ， 4°C过 夜渗出血清；
2)用于纯化抗体的抗原， 过脱盐柱 PD-10 ( GE Healthcare Life Sciences) ， 将洗脱缓冲液换成 NaPi缓冲液 （ 100 mM NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 8.2 ) ； 500 mM NaCl; 0.2 mM EDTA, ; 0.1% NP-40; 0.5mM PMSF ) ；
3 ) 15000g， lOmin离心， 取血清， 分装 9-10ml每管， -80°C保存备用； 4 ) 用 CNBr-activated sepharose 4B beads (有毒) ( GE Healthcare Life Sciences) 和抗原 （实施例 2制备的 GST融合蛋白） 结合来纯化抗体。 Beads 先要被激活。 根据经验， 0.6g beads能纯化 9-10ml血清。 称 0.6g beads至 1个 装有预冷的 ImMHCl的离心管中， 混匀， 直到完全溶解；
5)准备一个大吸引器， 一个有吸引器接口的大锥形瓶， 一个搪瓷漏斗（内 有孔洞） ， 两张与漏斗相匹配的 3M滤纸。 将 50ml含 beads液体倒在漏斗里， 加 450ml 预冷的 ImM HC1 ， 同时慢慢抽吸， 注意在抽吸过程中不能让 beads 变干。 整个抽吸过程大约 15分钟；
6) 用 500ml NaPi缓冲液再抽吸一次 （连续抽吸， 40秒钟左右完成） 。 剩 5ml左右 bf时 （注意不能抽干） ， 拔起搪瓷漏斗， 用 5ml枪将 beads收集， 再 加 5mlNaPi缓冲液收集剩余的 beads。 第 5、 6步尽快在 2分钟内完成。
7) 将 50ml离心管在室温旋转 1-3小时 （beads和抗原结合） ， 也可 4°C 过夜。 结合后离心 500g， 4°C， 5分钟， 再测上清的 OD280, 比较结合前后的 读值， 确定结合效率。 （计算方法： 蛋白总量 = ODX稀释倍数 X蛋白体积） 。 0.6gbeads的沉淀体积大约 2ml， 用 5倍沉淀体积 （10ml) 的 NaPi 缓冲液混匀 bead, 再离心后弃上清。
8) 在沉淀中加 100mMTris-HClPH8.0， 10倍沉淀体积 （20ml) ， 混匀， 室温转动 2小时或 4°C过夜， 用于封闭 beads上多余的蛋白结合位点；
9) 将 20ml含 beads的液体分两份倒入事先制备的两个玻璃棉柱中 （10ml 注射器， 玻璃棉约 lml) ， 塞上塞子静置 3分钟， 使 beads沉淀， 然后拿掉塞 子使液体自由滴下 （用 500ml塑料瓶接， 中间放泡沬塑料） 。
10)用以下 5种缓冲液洗 beads,每种体积为 10倍 beads沉淀体积，约 20ml: a) lOOmM Tris-HCl, PH 8.0， 含有 0.5MNaCl
b) 10 mM Tris-HCl, PH 8.0， 含有 0.5MNaCl
c) 200mM 甘氨酸， PH2.5, 含有 0.5MNaCl
d) 0.5M NaCl
e) 200mM 三乙胺， PHI 1.5， 含有 0.5MNaCl
f) 0.5MNaCl
11) 用 10倍沉淀体积的 NaPi缓冲液约 20ml再冲洗一遍 beads。
12)每 9ml血清中加 lml lMNaPi, PH8.2, 混匀。 56°C， 30min 灭活补体， 离心 12500g， lOmin离心， 取上清加到柱子中滤过， 滤出的血清再回到柱子中 再滤 2— 3次。
13 ) 用 10mM Na2HPO4/NaH2PO4， PH8.2, 以及 0.5M NaCl约 100ml滴洗 beads, 缓冲液经 50ml注射器及点滴管滴入柱子中；
14) 准备两个 15ml离心管，其中各加 1 ml 1M Na2HPO4/NaH2PO4， PH8.2, 在柱子中加 5ml lOOmM甘氨酸， PH2.5 , 以及 0.5M NaCl， 收集到含有 1M NaPi buffer, PH8.2的 15ml离心管中混匀；
15) 重复第 13步；
16) 准备两个 15ml离心管， 其中加 lml lM Na2HPO4/ NaH2PO4， PH8.2, 在柱子中加 5ml lOOmM 三乙胺， PHI 1.5， with 0.5M NaCl，收集到含有 1M NaPi 缓冲液， PH8.2的 15ml离心管中混匀。 合并两次滤过的抗体 （约 12ml) ； 17) Protein A 柱子换上连接注射器的接头 （仅一个） ， 注射器内装 10ml PBS, 拔去柱子的塞子， 用 PBS缓慢冲洗 （lml/min) ， 液体要滴出来， 不能打 进气泡。 （Protein A 柱子可重复使用纯化同一个抗体， 保存于 20%乙醇中） ； 18 ) 把 12ml抗体过柱， 可以过两遍。 用相应的 bf调零， 测定漏出液体的 OD280, 以检査结合效率， 确保流出液读值为 0;
19) 用 10ml PBS再洗一遍柱子；
20) 用 3ml 0.1M 柠檬酸 PH3.6 洗脱抗体， 洗脱液分 6个 ep管 （500ul/ 管）收集， 每管内事先加入 50ul lM Tris-HCl PH 9.0， 混匀。 用相应的 bf调零， 测定各管的 OD280, 确定浓度。 取浓度较高的 2-6管抗体， 共 2.5ml合并混匀； 21 ) 过脱盐柱 PD-10, 将洗脱缓冲液换成 PBS (2.5ml进， 3.5ml出） 。 测 定抗体的最终 OD280和总量。 分装 500每管， -80°C保存。 抗体浓度为 lug/ul 较为合适， 若抗体浓度过低， 则需加 BSA防止降解， 若过高则需加 NP-40 以 增加溶解度； 抗体 ( IgG) 总量 =0.75*OD280*体积；
22) 如下 WB ( Western Blotting) 检测抗体：
( a) 收集野生型 （WT ) 和 Stk40缺失 （KO) 的小鼠胚胎干细胞分化 9天 所形成的类胚体 （EB ) 样品， 用预冷的 l xPBS洗两次， 加入适当体积的 Co-IP 裂解缓冲液 （50 mM Tris-Cl, pH 7.5、 150 mM NaCl、 2 mM EDTA、 10% (v/v) glycerol, 0.5% NP-40, l mM NaF、 1 mM PMSF ) 进行裂解。 (b) 4°C振荡 15分钟， 12, OOOrprn, 4°C离心 10分钟， 取上清。
(c) BCA定量后取 20 g总蛋白量， 加 1/3体积 4xSDS上样缓冲液（200 mM Tris-Cl, pH 7.4、 8% SDS、 20% β-巯基乙醇、 40%甘油、 0.04%溴酚蓝） ， 沸水煮 5分钟。
(d) SDS-PAGE电泳分离。电泳缓冲液配方为： Tris 0.25M、甘氨酸 1.92M、 SDS 1%。
(e)将凝胶内的蛋白用电转移方法转移到硝酸纤维素膜上（200 mA,4 小 时） 。 转膜液配方为 0.025 M Tris, 0.192 M Glycine和 20%甲醇。
(f) 用含有 5%脱脂奶粉或 5%BSA的 TBS-T缓冲液 （0.02 M Tris-Cl, pH 7.6、 0.137 MNaCK 0.1% Tween-20) 室温封闭 1小时后， 弃去封闭液。
(g) 加入一定量适当稀释于含 5%脱脂奶粉的 TBS-T缓冲液中的抗小鼠 Stk40蛋白的一抗 （Stk40-C72以及 Stk40-C98多克隆抗体） ， 4°C过夜。 （h) 弃去一抗， TBS-T缓冲液清洗 3次， 每次 5分钟。
(i)将一定量抗兔的辣根过氧化物酶偶联的二抗（图 4中显示的 Ab2)稀 释于含 5%脱脂奶粉的 TBS-T缓冲液中的，室温孵育 1?2小时；弃去二抗， TBS-T 缓冲液清洗 3次， 每次 5分钟。
(j) 在膜上滴加 Pierce化学发光底物， 然后用 X光片曝光， 经冲片机自 动显影定影。
图 4显示了利用 Stk40-C72多克隆抗体进行 Western blotting检测野生型 (WT)和 Stk40缺失（KO) 的小鼠胚胎干细胞分化 9天所形成的类胚体（EB) 中 Stk40的蛋白表达情况。结果显示在野生型 EB样品中能检测到 Stk40的明显 表达 （?50kDa处的条带） ， 而在 Stk40缺失的 EB样品中则检测不到相应的 条带， 说明该多克隆抗体能特异性地识别小鼠 Stk40蛋白。 实施例 5: 抗体活性检测
按实施例 4步骤（22)进行 WB检测， 只不过使用 Stk40-C98抗体（Lingjie Li*、 Lei Sun*,等， Stk40 Links the Pluripotency Factor Oct4 to the Erk/MAPK Pathway and Controls Extraembryonic Endoderm Differentiation PNAS.2010 J 107(4): ) 替换本申请的 Stk40-C72多克隆抗体进行检测。 结果显示在图 5中。 图 5显示， 采用的 Stk40的 C端 98个氨基酸 （C98 ) 作为抗原段制备的抗体 （Stk40-C98 ) 虽然能够识别 Stk40蛋白， 但是非特异性 带 （杂带） 较多， 而且某些杂带离目的条带很近， 只有在跑胶时蛋白充分分离 的情况下才能看到。 虽然以具体实施例的方式描述了本申请， 但是应理解， 在不偏离本申请的 精神的情况下， 可对本申请作出适当的变动和修改。 这些都在本申请权利要求 所限定的保护范围之内。
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