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血红铆钉菇研究现状及开发利用
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&&血​红​铆​钉​菇​是​菌​根​性​食​用​菌​,​既​能​促​进​树​木​生​长​,​又​是​人​们​不​可​多​得​的​无​公​害​的​山​珍​佳​肴​。​为​了​使​血​红​铆​钉​菇​的​研​究​更​加​深​入​,​从​生​物​学​、​生​态​学​、​分​离​培​养​、​拮​抗​作​用​、​促​生​长​作​用​等​方​面​研​究​现​状​进​行​了​概​述​,​并​提​出​了​开​发​利​用​方​向​。
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血红铆钉菇化学成分及其抗肿瘤活性的研究
【摘要】：恶性肿瘤是当今难以治愈、死亡率极高的重要疾病之一，其中肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。虽然辅助化疗已经取得了一定进展，但现有的化疗药物仍主要是传统的细胞毒类化疗药物，在治疗的同时对人体正常细胞产生许多毒副作用，不具备理想的治疗效果。因此，有必要开发抑瘤效果好且毒副作用小的抗肿瘤新药，尤其是从天然物质中分离得到的天然活性成分已成为当今研究的热点。血红铆钉菇是一种野生大型外生菌根菌，营养价值丰富，具有广泛的药理活性，本实验目的是通过小鼠体内筛选找到血红铆钉菇中具有抗肿瘤活性的天然单体化合物，并结合体外抗肿瘤效果阐明其在治疗肝癌过程中的作用，并进一步研究了其细胞凋亡的抗肿瘤机理及可能的凋亡通路，为天然活性单体物质作为抗肿瘤药物治疗肝癌提供实验依据。
本论文用梯度提取法对血红铆钉菇干品进行初步的提取分离，利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对其石油醚提取物化学成分及含量进行测定，并依据国家检验标准对其干燥子实体的重金属及微量必须元素含量进行较为系统的评价。同时对氯仿层、乙酸乙酯层和丙酮层提取物进行化学成分的分离鉴定，并用乙醇法提取法进行提取得乙醇提取物，用大孔树脂D101进行初步分离，得红色和黄色组分，将所得红色组分、黄色组分和乙醇提取物进行体内抗肿瘤活性初筛，选用肝癌腹水瘤H22小鼠模型，筛选出的活性组分进行化学分离得到单体化合物——绒盖牛肝菌酸，并进一步验证其体内抗肝癌活性，同时应用HE染色法、Bax和Bcl-2免疫组化观察，对肿瘤组织进行了病理学研究。体外用SRB法检测绒盖牛肝菌酸抑制肿瘤细胞增殖的情况，用倒置显微镜观察绒盖牛肝菌酸处理后的肿瘤细胞形态变化，流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法检测不同浓度绒盖牛肝菌酸对肝癌细胞HepG2的细胞凋亡作用。最后用western blot检测细胞凋亡诱导通路Bcl-2（抑细胞凋亡蛋白）、Bax（促细胞凋亡蛋白）、Cyt-c（细胞色素C）、PARP（DNA修复酶）的蛋白表达水平。
对血红铆钉菇子实体化学成分的提取分离及鉴定结果为：分离得到5个单体化合物，共鉴定出3个化合物，分别是软脂酸-1-甘油脂、腺苷和绒盖牛肝菌酸，均为首次从血红铆钉菇中分离得到。体内抗肝癌腹水瘤H22初筛结果：黄色组分为抗肝癌活性组分，并进一步分离鉴定得到单体化合物——绒盖牛肝菌酸，经体内H22抑瘤实验验证了绒盖牛肝菌酸就是抗肝癌的天然活性成分，抑瘤率达57.71%，与阳性组（57.89%）接近。绒盖牛肝菌酸能显著抑制HepG2、Bel-7402、MCF-7、Hela四种肿瘤细胞系的增殖，呈剂量依赖性，具有较为广谱的抑瘤效果，抑制中浓度IC50分别为41.37±0.36μg/ml、37.09±0.69μg/ml、80.84±1.06μg/ml、68.25±0.58μg/ml。倒置显微镜观察表明绒盖牛肝菌酸干预后的四种肿瘤细胞的细胞形态均有明显的变化，细胞皱缩变小，形状不规则。Annexin-V-FITC/PI双染法检测结果发现绒盖牛肝菌酸呈剂量依赖性诱导HepG2细胞凋亡，与对照组相比较，当绒盖牛肝菌酸的作用剂量为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml时，HepG2细胞凋亡率显著上升到5.68±0.27%、19.28±1.21%、21.38±1.98%。Western blot检测结果表明，不同浓度绒盖牛肝菌酸干预后，可显著上调Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白表达，进而使胞质中Cyt-c的含量逐渐升高，最终降低细胞内PARP的含量，其降解产物cleaved PARP的表达量增加。
采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术，鉴定了血红铆钉菇子实体石油醚提取物中8个化合物，其主要含有亚油酸和十八碳烯酸等不饱和脂肪酸。经检验，血红铆钉菇干燥子实体中含有重金属元素总砷、铅、汞、镉，其含量均未超过国家标准，并含有大量人体所必需的铜、锌、铁、钙、硒、铬6种微量必须元素。同时，从血红铆钉菇子实体中分离得到并鉴定出的3种单体化合物软脂酸-1-甘油脂、腺苷和绒盖牛肝菌酸，均为首次从血红铆钉菇中分离得到。通过体内抗H22肿瘤实验反复筛选得到的单体化合物绒盖牛肝菌酸，体外不仅能显著抑制肝癌细胞系HepG2和Bel-7402的增殖，对其他常见的肿瘤细胞系MCF-7和Hela也有很好的抑瘤效果，表明绒盖牛肝菌酸有较为广谱的抗肿瘤效果。并进一步研究证明了其对肝癌细胞HepG2的抑制机理为细胞凋亡。通过对细胞内Bcl-2、Bax、Cyt-c和PARP蛋白表达水平的检测，初步判断该化合物是通过线粒体内源途径诱导HepG2肝癌细胞凋亡。
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：R284;R285【目录】：
摘要3-5Abstract5-8目录8-10前言10-12第一章 血红铆钉菇的研究现状12-18 1.1 生物学特性12-13 1.2 化学成分13-14 1.3 药理活性14-17 1.4 前景展望17-18第二章 血红铆钉菇子实体化学成分的研究18-27 2.1 实验材料、试剂及仪器18 2.2 实验方法18-20 2.3 结果与分析20-26 2.4 小结与讨论26-27第三章 血红铆钉菇子实体抗肿瘤活性成分的研究27-39 3.1 血红铆钉菇子实体提取物的体内抗肿瘤实验研究27-30 3.2 对粉色组分、黄色组分和乙醇提取物作用的肿瘤组织的病理学研究30-32 3.3 血红铆钉菇子实体抗肿瘤活性成分的研究32-34 3.4 绒盖牛肝菌酸体内抗肿瘤活性研究34-36 3.5 活性成分绒盖牛肝菌酸作用的肿瘤组织病理学研究36-37 3.6 小结与讨论37-39第四章 绒盖牛肝菌酸的体外抗肿瘤机理的研究39-48 4.1 实验材料39-40 4.2 实验方法40-42 4.3 结果与分析42-46 4.4 小结与讨论46-48第五章 结论48-50 5.1 血红铆钉菇化学成分的研究48 5.2 体内抗肿瘤活性成分的筛选48-49 5.3 体外抗肿瘤机理研究49 5.4 创新点49-50参考文献50-55附录55-61作者简介61-62致谢62
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