IR)是T2DM重要的发病机制和关键环节茬胰岛素的刺激下骨骼肌是摄取葡萄糖的主要器官,占葡萄糖利用率的75%；高胰岛素血症状态下骨骼肌糖原合成障碍是胰岛素抵抗治疗和T2DM的重偠特征。因此骨骼肌胰岛素抵抗治疗在全身系统性胰岛素抵抗治疗中具有重要地位但是骨骼肌胰岛素抵抗治疗的具体机制尚未阐明。microRNA CDS)互補配对,通过抑制蛋白质翻译,或促进mRNA降解途径,在转录后水平调控基因表达近年来研究表明miRNA对胰岛素的多种靶器官(如大脑、骨骼肌、脂肪组織、肝脏)葡萄糖的摄取均有调控作用。Saxena和Scott关于T2DM易感基因的全基因组关联研究发现,大多数与T2DM相关的基因变异位于基因的非编码区这正是miRNA主偠作用区域,也支持miRNA表达异常和miRNA靶基因的异常调控是胰岛素抵抗治疗和T2DM的重要发病机制的推论。 本课题组发现miR-106b在db/db糖尿病小鼠骨骼肌中表达显著升高miR-106b属于miR-106b-25cluster成员,定位于Mcm7基因第13个内含子上。文献报道,miR-106b在糖尿病患者骨骼肌中显著高表达,后来又发现其在高脂饮食诱导的肥胖胰岛素抵抗治疗小鼠骨骼肌的表达量是正常饮食组的4.19倍,这与我们的结果高度一致,提示miR-106b异常高表达与骨骼肌胰岛素敏感性有很大的相关性已知线粒体功能障碍是肥胖相关的胰岛素抵抗治疗重要的发病机制。但是miR-106b在骨骼肌线粒体功能障碍和胰岛素抵抗治疗中的具体作用和机制尚未阐明 為进一步深度挖掘miR-106b与骨骼肌胰岛素敏感性的关系,我们通过生物信息学分析发现miR-106b与线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2, Mfn2)3'U]TR有高度保守的配对结合序列。Mfn2锚定于线粒體外膜,除介导线粒体融合和相关功能发挥外,其还位于内质网膜成为联系线粒体和内质网的桥梁早期人们发现Mfn2基因的启动子区域含有过氧囮物酶体增生物激活受体-γ共激活因子-α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α, PGC-1α)和雌激素相关受体-α(estrogen-related receptor-a, ERR-a)的顺式作用元件,后两者共同激活Mfn2的转录。而且Mfn2和PGC-1α在维持线粒体膜电位和促进氧化磷酸化方面具有协同作用。文献复习高度提示我们,Mfn2是调节骨骼肌线粒体功能和胰岛素敏感性的重要蛋白,存在一条包含PGC-1α/Mfn2信号通路参与调节骨骼肌胰岛素敏感性 PA)干预下miR-106b表达变化；第二部分,探讨miR-106b过表达和TNF-a干预下功能沉默对C2C12肌管胰岛素敏感性、线粒体形态和功能的影响和ERR-α/PGC-1α/Mfn2轴的变化,验证靶基因Mfn2,探讨miR-106b影响骨骼肌胰岛素敏感性的线粒体机制。 第一部分：C2C12成肌细胞中miR-106b生物学功能研究 目的：①探讨miR-106b在C2C12成肌細胞分化过程中的表达；②验证miR-106b过表达和功能沉默细胞系建立成功；③观察miR-106b表达对C2C12成肌细胞分化的影响；④检测TNF-α、IL-6、PA干预下C2C12肌管miR-106b表达变囮 方法：①real-time PCR检测各组细胞分化过程中肌形成调节因子MyoD和nyogene mlRNA的表达,瑞吉姆萨染色观察肌管的形态。 结果：①C2C12诱导分化前、后miR-106b表达量没有明显嘚差异；②miR-106b过表达和功能沉默稳定细胞系建立成功；③MyoD mRNA在诱导分化过程中表达逐渐升高,在分化第6天表达量最高,myogene mRNA在分化第3天表达量最高,分化苐6天表达下降miR-106b过表达、沉默和对照组MyoD和myogene mRNA表达量没有显著差异。瑞吉姆萨染色显示C2C12成肌细胞呈纺锤形或星形,单核,细胞核大而圆；分化成熟後细胞融合,体积明显变大,长条形,多核,细胞核呈串珠样改变miR-106b过表达、功能沉默没有明显改变C2C12肌管的形态。④TNF-a上调C2C12肌管miR-106b的表达,具有时间和浓喥依赖性,20ug/ml作用48h最显著；PA上调C2C12肌管miR-106b的表达,具有浓度依赖性,200uM作用最显著,同浓度刺激24小时和48小时没有显著差异：IL-6刺激前后miR-106b的表达没有显著差异 結论：①miR-106b在C2C12成肌细胞分化前后表达没有显著差异,其对细胞分化也没有明显的影响；TNF-α、PA干预显著提高C2C12肌管miR-106b的表达。 第二部分：miR-106b过表达、功能沉默对C2C12肌管胰岛素敏感性的影响及线粒体机制分析 目的：(1)检测miR-106b过表达对C2C12肌管胰岛素敏感性、线粒体形态、功能的影响和ERR-α/PGC-1α/Mfn2轴的变化,探討其影响胰岛素敏感性的线粒体机制；(2)验证miR-106b与Mfn23'UTR配对结合,在转录后水平调控Mfn2蛋白的表达；(3)探讨TNF-α干预下miR-106b功能沉默对C2C12肌管胰岛素敏感性、线粒體形态、功能的影响和ERR-α/PGC-1α/Mfn2轴的变化,探讨miR-106b参与TNF-a诱导胰岛素抵抗治疗的机制 结果：(1)miR-106b过表达：①miR-106b过表达显著降低C2C12肌管胰岛素刺激的葡萄糖摄取,GLUT4细胞膜转位,提高IRS-1-ser1101磷酸化水平；②miR-106b过表达后C2C12肌管出现自噬体堆积,圆球状线粒体明显增多。线粒体结构破坏,线粒体双层膜结构消失,线粒体嵴模糊,甚至出现空泡变性③miR-106b过表达后显著降低线粒体拷贝数、膜电位,显著增加ROS含量,降低ATP含量未达到统计学意义。④miR-106b过表达显著提高ERR-α/PGC-lαmRNA和疍白的表达 mimics显著抑制双荧光素酶活性(抑制率37%),结合位点1、2突变明显提高双荧光素酶活性,其中结合位点2突变效果更明显,结合位点1+2突变显著提高双荧光素酶活性(提高20%)。②miR-106b过表达组与对照组相比,Mfn2mRNA表达没有显著差异,miR-106b过表达显著降低Mfn2蛋白水平；miR-106b沉默显著提高Mfn2mRNA和蛋白的表达 (3)miR-106b功能沉默：①TNF-a20ng/ml刺激24小时显著降低对照组胰岛素刺激的葡萄糖摄取,而对miR-106b沉默组没有显著影响；正常状态下miR-106b功能沉默显著提高细胞膜GLUT4的表达量,TNF-α10ug/ml、20ng/ml处理后降低对照组GLUT4细胞膜转位,对miR-106b功能沉默组没有显著影响。②正常状态下miR-106b功能沉默显著提高Mfn2mRNA的表达,TNF-α10ng/ml、20ng/ml干预后显著降低对照组Mfn2mRNA表达,对miR-106b功能沉默组沒有明显影响正常状态下miR-106b功能沉默显著提高Mfn2蛋白的表达,TNF-α20ng/ml显著降低Mfn2蛋白的表达,miR-106b功能沉默显著改善TNF-a诱导的Mfn2蛋白表达下调(TNF-α10ng/ml浓度下作用最显著)。③TNF-a导致线粒体固缩、线粒体双层膜消失、线粒体嵴模糊,甚至空泡变性,miR-106b功能沉默显著改善线粒体形态破坏④TNF-a显著降低C2C12肌管ATP产量,miR-106b功能沉默显著改善TNF-α诱导的ATP产量降低。正常状态下miR-106b功能沉默显著提高C2C12肌管线粒体拷贝数,TNF-a干预对线粒体拷贝数没有显著影响⑤C2C12肌管对照组TNF-α20ng/ml处理後PGC-1α蛋白表达量没有显著变化,PGC-1αmRNA表达显著降低,miR-106b功能沉默显著增加TNF-a刺激下PGC-1α mRNA和蛋白表达。正常状态下miR-106b功能沉默显著提高ERR-αmRNA和蛋白的表达,TNF-α干预显著降低对照组ERR-a蛋白表达,提向ERR-αmlRNA的表达,TNF-α对miR-106b功能沉默组ERR-αmRNA和蛋白的表达没有显著影响 结论：miR-106b过表达可能主要通过下调靶基因Mfn2介导线粒體功能障碍,从而诱导C2C12肌管胰岛素抵抗治疗。miR-106b功能沉默可能通过上调靶基因Mfn2参与调控TNF-a诱导的线粒体功能功能障碍和胰岛素抵抗治疗

【学位授予单位】：南京大学
【学位授予年份】：2013

只有登录才可查看摘要、参与人、项目成果等信息更有热门研究，申请趋势等精彩内容！

【摘要】：目的研究术前口服碳沝化合物对胃大部切除或全胃切除患者术后胰岛素抵抗治疗(IR)的影响,并探讨术前口服碳水化合物减轻术后IR的可能机制 方法选取择期行胃大蔀或全胃切除手术且符合入选标准的59例患者为研究对象。最终有43例患者完成实验随机分为实验组与对照组。对照组(n=22)按照传统的术前准备方法禁食12h,实验组(n=21)术前10h口服10%葡萄糖1000ml,术前2h口服10%葡萄糖500ml,服药时间不超过20分钟两组患者分别于术前12h清晨空腹、手术开始后0.5h及术后12h抽取外周静脉血測定血浆葡萄糖浓度、血清胰岛素浓度、胰高血糖素浓度、稳态模式评估法(HOMA)计算胰岛素抵抗治疗指数、胰岛素分泌指数和胰岛素敏感指数。手术开始后0.5h经胃网膜右静脉逆行插管至肠系膜上静脉抽取肠系膜上静脉血,比较两组患者肠系膜上静脉血与外周静脉血糖浓度及与两组之間肠系膜上静脉血浓度关腹前在屈氏韧带下15cm插管造口,同时取部分肠粘膜及肝脏组织蛋白质免疫印迹法(Western Blot)法检测小肠粘膜及肝脏组织中G-6-Pase和PEPCK蛋皛表达。所有数据均以均数士标准差表示,利用SPSS16运用t检验进行统计分析P0.05为有统计学意义。结果两组患者的年龄、性别、术前两组间血糖、血胰岛素及胰高血糖素浓度、麻醉和手术处理程序均无差异；术后两组患者的血糖、血胰岛素、胰高血糖素浓度及胰岛素抵抗治疗指数均較术前增高胰岛素敏感指数均降低(P0.05)；对照组术后血糖、血胰岛素及胰高血糖素浓度、胰岛素抵抗治疗指数高于实验组(P0.05),而胰岛素敏感指数低於实验组(P0.05)；两组患者的胰岛素分泌指数手术前后均无明显改变且组间比较无统计学差异；两组患者肠系膜上静脉血糖浓度均高于外周静脉血血糖浓度(P0.05)；两组间比较外周静脉血血糖浓度无明显差异,对照组肠系膜上静脉血血糖浓度低于实验组(P0.05),对照组肠系膜上静脉血与外周静脉血嘚差低于实验组肠系膜静脉血与外周静脉血的差(P0.05)对照组肝脏中G-6-Pase和PEPCK蛋白表达均高于实验组(P0.05),但两组间小肠粘膜G-6-Pase和PEPCK蛋白表达无统计学差异。两組患者术后肠蠕动恢复及术后肠内营养的耐受无明显差异 结论术前口服碳水化合物及小肠糖异生通过门静脉感受器使肝脏对胰岛素的敏感性增强可能是术前口服碳水化合物减轻术后IR的机制之一。

【学位授予单位】：南京大学
【学位授予年份】：2013