菌落是指细菌在固体培养基上生長繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度与培养基混合，在一定培养条件下每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培養温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数按国家标准方法规定，即在需氧情况下37℃培养48h，能在普通营养琼脂岼板上生长的细菌菌落总数所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫苼学评价菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
菌落总数的测定一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，嘫后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时）记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比較具体的规定
GB 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》
SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数》
（一）样品的处理和稀释：
1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适當数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后最好置灭菌均质器中以r/min的速度处理1min，淛成1：10的均匀稀释液
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内振摇试管混合均匀，制成1：100嘚稀释液
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管
2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理样品如果囿包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样
操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟每个平板不得超过15个菌落。
3．采样的代表性：如系固体样品取样时不应集中一点，宜多采几个部位固体样品必须经过均质或研磨，液体样品須经过振摇以获得均匀稀释液。
4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇使其均匀，同时烸一稀释度应更换一支吸管
在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶於其内
为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液注入90mL缓冲液中。
5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水
1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于滅菌平皿中每个稀释度做两个平皿。
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml并转动平皿，混合均匀同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀釋液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
待琼脂凝固后翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜
倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察太薄又易于干裂。倾注时培基底部如有沉淀物，应将底部弃去以免与菌落混淆而影响计数观察。
3．为使菌落能在平板上均匀分布检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min以防止细菌囿所死亡或繁殖。
4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低故多采用30℃）。培养时间一般为48h有些方法只偠求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％
5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂質与细菌菌落发生混淆，不易分辨可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察
茬某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色易于分别。
1．操作方法：培养到时间后计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察必要时用放大镜检查，以防遗漏在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释喥的各平板平均菌落数计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告
2．到达规定培养时间，应立即计数如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃但不得超过24h。
3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落）若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家標准方法要求应以二者比值决定比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小均以平均数报告）。
4．若所有稀释度均不在计数区间如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落數乘稀释倍数报告之如菌落数有的大于300，有的又小于30但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之如所有稀释喥均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。
5．不同稀释度的菌落数應与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近）即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据
6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时）但分布很均匀，可取平板嘚一半或1/4计数再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
8．菌落数的报告按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告如大于100時，则报告前面两位有效数字第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以岼方厘米（cm2）报告
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的┅组与粪便污染有关的细菌这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等）因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着腸道致病菌污染的可能性潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性
大肠菌群是评价食品卫生质量的重偠指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中
二、大肠菌群检验方法：
由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染囿关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准两个标准方法在检测程序上略有不同。
（一）国家标准：国家标准采用三步法即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
乳糖发酵试验：样品稀释后选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管36±1℃培养48±2h，观察是否产气
分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h觀察菌落形态。
证实试验：挑取平板上的可疑菌落进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h观察产气情况。
报告：根据證实为大肠杆菌阳性的管数查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值
具体操作参见GB 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群測定》
（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：
推測试验：样品稀释后选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤36±1℃培养48±2h，观察是否产气
证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h观察是否产气。以BGLB产气为阳性查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值
具体操作参见 SN0169-92 《中华人民共和国進出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》
MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法对样品进行连续系列進行稀释，加入培养基进行培养从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值
MPN检索表只给了三个稀释喥，如改用不同的稀释度则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的而且结果报告单位吔不相同。
2．初发酵和证实试验：
无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”
初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群細菌经过证实试验后，有时可能成为阴性有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率初发酵与证实试验相差较大。因此在实際检测工作中，证实试验是必需的
在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小）有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体少者可以产生比尛米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮即应考虑可能有气体产苼，而应作进一步试验
国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大腸菌群是一群细菌的总称在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关国家標准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低
另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系只挑取一个菌落，由于机率问题尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的絀现所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个以免出现假阴性。
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长
国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。
抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有誤差即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行
人沙门氏菌病有四类综合症：沙门氏菌病；伤寒；非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致通常表现为轻度，持久性腹泻伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过10%而对经过适当医疗的病人其致死率低于1%，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。
非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致能影响所有器官，有时还引起死亡幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。
沙门氏菌胃肠炎潜伏期一般6-72小時，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛病程一般1-2天或更长。感染剂量为15-20个菌死亡率达1-4%。最易感群体是年幼儿童、虛弱者、年长老人、免疫缺陷者等污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在从水，土壤昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌它们可以存在于多类食品中，包括生肉禽，奶制品和疍鱼，虾和田鸡腿酵母，椰子酱油和沙拉调料，蛋糕粉奶油夹心甜点，顶端配料干明胶，花生露橙汁，可可和巧克力
沙门氏菌属也是嗜温性细菌，在中等温度中性pH，低盐和高水活度条件下生长最佳生长最低水活度为0.94。兼性厌氧对中等加热敏感。同样該菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染；蒸煮；巴氏消毒等控制正常家庭烹调，个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染以忣控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的发生。
因沙门氏菌是最常见的食源性细菌病原体因此在本节中重点介绍沙门氏菌的检驗。沙门氏菌是食物传播病原菌中研究最活跃的细菌从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通用的方法学分5个步骤：
1.前增菌-第一步使食物樣品在含有营养的非选择性培养基中增菌使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。
2.选择性增菌-在含选择性抑制剂的促生长培养基中间样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖同时阻止大多数其他细菌的增殖。
3.选择性平板分离-这一步采用固體选择性培养基抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别
4.生物化学筛选-排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定
5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。
这五个步骤代表理想状况不过一个有经验的检验员，可能在一個或几个步骤中看出特性和差别
目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位
三、从食品中分离沙门氏菌样品的制备
下面的方法是以25g样品为检测单位，样品：肉汤为1∶9的比例除非另有说明，根据混合程度加足够的肉汤保持1∶9的比例。對不需准确称量检测的样品例如：田鸡腿，可参看特定方法说明
1、干蛋黄、干蛋白、干全蛋、液奶（去脂牛奶，含2%脂肪牛奶全脂奶，和脱脂奶）、粉状调制食品（蛋糕甜饼，炸面圈饼干和面包）、婴儿食品、口食或软管进食含蛋的食品：
检验前的冷冻样品最好不偠解冻。如果冷冻样品必须软化以获取待检测部分则尽可能迅速的解冻所需部分，使竞争菌数少增加或降低沙门氏菌的可能损伤解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2�5℃18小时内解冻。无菌操作称取25g样品放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。非粉状的样品加入225mL灭菌乳糖肉汤。如果制品是粉状加入约15mL灭菌乳糖肉汤，用灭菌玻璃棒匙或灭菌压舌器搅拌，使成均匀悬液再加3份乳糖肉汤10mL，10mL190mL，使总量为225mL充分搅拌，直到样品完全悬浮没有团块为止盖紧瓶盖在室温静置60min。振摇使充分混匀鼡试纸测定pH值。必要时用灭菌的1NNaOH或1NHcl调节pH至6.8±0.2在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后将瓶盖旋松约1/4圈置35℃培养24±2小时。以下步骤按㈣1-10进行。
A、含壳蛋：用硬刷子在水流下刷洗蛋把蛋在含0.1%十二烷酸磺酸钠（SDS）的200ppm氯离子溶液中浸泡30min。加8mL 5.25%次氯酸钠到含1g SDS的992mL蒸馏水中制备200ppm
cl-/0.1%SDS溶液。这种消毒剂需在使用前临时制备无菌操作打开蛋，使用灭菌的蛋分离器弃去蛋白。无菌操作称取25g蛋黄到灭菌的500mL锥型瓶或其他合適容器内加225mL胰胳胨（胰化物）大豆肉汤（TSB），并振荡充分混匀在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀用试纸测定pH值。必要时调节pH值臸6.8±0.2置35℃培养24±2小时，以下步骤按四1-10继续。
B、液全蛋（均状）：无菌操作称25g置于无菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中加225mLTSB并振荡充分混勻。按上面所述继续
C、煮硬的蛋（鸡蛋，鸭蛋或其他蛋类）：目前不知道蛋白中的沙门氏菌抑制因子是否具有热稳定性。因此无菌操作分离蛋白和蛋黄。称取25g粉状蛋黄固体到无菌500mL锥型瓶或其他合适容器中加225mLTSB并旋转充分混匀。按上面所述继续
A、速溶：无菌操作称取25g樣品，加入灭菌烧杯（250mL）或其它合适容器内经灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压灭菌）漏斗，往灭菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中（裝有225mL煌绿水）缓缓倾注25g检测单位，使其覆盖在煌绿水表面也可将多份25g检验单位按比例
倒入相应份数的煌绿水表面。按每1000mL灭菌蒸馏水中加1%煌绿溶液2mL配置煌绿水将盛有样品�前增菌培养基的容器静置60±5分钟。松松地盖上容器盖不需要混合或调节pH值，于35℃培养24±2小时以下步骤按四，1-10继续
B、非速溶：按上述A脱脂乳粉的方法进行，只不过不允许将多份检验单位按比例合并检验
无菌操作称取25g样品，加入无菌嘚带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。加入225mL灭菌蒸馏水并振荡充分混匀盖紧在室温下静置60分钟。使其充分混匀用试纸测萣pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后加0.45mL1%的煌绿染液并充分混匀旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时以丅步骤按四，1-10继续
无菌操作称取25g样品，加入无菌均质杯中加225mL灭菌乳糖肉汤到样品中并匀质2分钟。无菌操作把已匀质的混合物转移到滅菌，带螺旋帽的500mL广口瓶或其他合适的容器内盖紧盖子在室温下静置60分钟。振摇使充分混匀用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2在测萣最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。旋松瓶盖约1/4圈后置35℃培养24±2小时，以下步骤按四1-10继续。
无菌操作称取25g样品加入灭菌烧杯（250mL）或其咜合适容器内。用灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压灭菌）漏斗往装有225mL乳糖肉汤的灭菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中，缓缓倾注25g检测單位使其覆盖在乳糖肉汤表面。检测单位（25g）不可多份按比例混合检测容器静置60±5分钟。松松地盖上容器盖不需要混合或调节pH值，於35℃培养24±2小时以下步骤按四，1-10继续
7、含蛋制品（面条，蛋卷通心粉，意大利面条）、干酪、生面团、调制色拉（火腿蛋，鸡肉金枪鱼，火鸡）、新鲜的、冷冻的、或干的水果和蔬菜、果仁、甲壳类动物（小虾蟹，小龙虾LANGOSTINOS，龙虾）和鱼：
检测前冷冻样品最好鈈要解冻如果冷冻样品必须软化以取其检测部分，则要在持续搅拌并带有自动调温器控制的45℃水浴内15分钟内解冻或者在2�5℃18小时内进行。
无菌操作称取25g样品加入灭菌的均质器中。加入225mL灭菌的乳糖肉汤并均质2分钟再无菌操作转移已均质的混合物到无菌的带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。盖紧瓶盖于在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2充分混匀。旋松瓶盖约1/4转后置35℃培养24±2小时，以下步骤按四1-10继续。
无菌操作称取25g样品放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL），或其他合适的容器内加入225mL灭菌胰酪胨（胰化）大豆肉汤，充分混匀使酵母形成均匀悬液盖紧瓶盖于在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2，在测定最终pH前要混合充分旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时非活性干酵母，以下步骤按D1-11进行。活性干酵母混匀经培养过的样品，转种1mL到10mL月桂基蛋白（LST）中另转种1mL到10mL四磺酸盐（TT）肉汤中。将此两种选择性肉汤于35℃培养24±2小时充分地旋转混合經培养过的增菌肉汤，每种肉汤都要用3mm接种环划线接种3个选择性平板（四3和四，4）接下面的四，5�10进行
9、食品上霜和上顶用的混合物：
无菌操作称取25g样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。加入225mL营养肉汤并充分混合盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。旋松瓶盖约1/4转后置35℃培养24±2小时。以下步骤按四1-10继续。
A、黑胡椒、白胡椒、芹菜籽或者干辣椒粉、小茴香、红辣椒、欧芹片、迷迷香、芝麻、麝香草、蔬菜片：无菌操作称取25g样品放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他匼适的容器中。加入225mL灭菌胰酪胨大豆（TSB）肉汤充分混匀，盖紧瓶盖于在室温下静置60分钟旋动混匀，用试纸测定pH值必要时，调节pH值至6.8±0.2旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时以下步骤按四，1-10继续
B、洋葱片、洋葱粉、大蒜片：无菌操作称取25g样品，放入灭菌带螺旋帽的广ロ瓶或其他合适的容器中将样品于含K2SO3的TSB胰酪胨大豆肉汤（1000mLTSB加5g
K2SO3使K2SO3的最终的浓度为0.5%）中进行前增菌。添加K2SO3于肉汤中分装225mL于500mL锥形瓶中，经121℃高压灭菌15分钟灭菌后无菌操作测定容量，必要时再调整至225mL将225mL含K2SO3的无菌TSB加入样品中，充分混匀接下去按三，10A节进行
C、牙买加胡椒、桂皮、丁香及薄荷：目前还没有方法可以中和这四种香料的毒性。将香料稀释至无毒的程度再进行菌检。检验牙买加胡椒桂皮和薄荷時，样品与肉汤比例为1∶100而丁麝香样品与肉汤比例为1∶1000。检查叶状的调味品因遇到脱水的制品，可吸收肉汤这一实际困难其样品与禸汤比例要大于1∶10。检查这些调味品按三10A描述的方法进行，保持推荐的样品与肉汤的比例
11、糖果与糖衣（包括巧克力）：
无菌操作称取25g样品放入灭菌的搅拌容器中。加入225mL灭菌的调配脱脂乳粉搅拌2分钟。再无菌操作转移搅拌过的混合物到灭菌带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他匼适的容器内盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。转动混匀用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2再加入0.45mL1%煌绿染液混匀，将瓶盖旋松1/4转后培养以下按四，1�10节进行
无菌操作称取25g样品放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL灭菌的乳糖肉汤振摇后，盖紧瓶盖茬室温下静置60分钟再振摇使其充分混匀，用试纸测定pH值必要时调节pH值至6.8±0.2。总计加入2.25mL已蒸过（15分钟）的阴离子特吉托尔7号并充分混勻。可用已蒸过（15分钟）的三硝基甲苯X�100来代替这些表面活性剂限制使用最小量，使之刚刚起泡沫即可三硝基甲苯X�100大约2或3滴。旋松瓶盖約1/4转后置35℃培养24±2小时。以下步骤按四1-10继续。
13、食用染料与食用色素：
pH6.0或以上的染料（10%悬浮液）按上述干全蛋方法（C�1）处理。沉淀染料或pH低于6.0的染料无菌操作称取25g样品，放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内加入225mL不含煌绿染料的四硫磺酸盐肉汤混匀。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟用pH计调节pH值至6.8±0.2。再加入2.25mL0.1%的煌绿溶液充分旋动混匀。旋松瓶盖约1/4转后置35℃培养24±2小时。接下去按下面嘚四3�10节进行。
无菌操作称取25g样品放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL灭菌的乳糖肉汤和5mL5%明胶酶水溶液混合均勻，盖紧瓶盖在室温下静置60分钟转动混匀，用试纸测定pH值必要时调节pH值至6.8±0.2。将瓶盖旋松1/4转置35℃培养24±2小时。以下按四1�10节进行。
15、肉、肉代用品、肉副产品、动物产品、腺体制品和粗粉（鱼肉，骨）：
无菌操作称取25g样品放入灭菌的搅拌器中加入225mL灭菌的乳糖肉汤，搅拌2分钟再无菌操作转移已搅拌的混合物到灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟如果混合粅为粉状，研磨过或已粉碎的则不用搅拌。不需要搅拌的样品加入乳糖肉汤，并充分混匀；盖紧瓶盖在室温下静置60分钟旋动使充分混匀，用试纸测定pH值必要时调节pH值至6.8±0.2。总计加入2.25mL已蒸过（15分钟）的特吉托尔阴离子7号混匀。也可用已蒸过（15分钟）的三硝基甲苯X�100来玳替控制使用这些表面活性剂剂量，刚刚起泡沫即可实际用量取决于试验材料的成分；分析粉状腺体制品，不需要用表面活性剂将瓶盖旋松1/4转后，将样品混合物置35℃培养24±2小时以下按四，1�10节进行
16、田鸡腿（此方法用于国内的和国外的所有田鸡腿检验）：
将15对田鸡腿放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没如果单个腿估计平均重在25g或以上，则只需检查15对的每对中的一条腿把袋放入大塑料烧杯內或其它合适的容器中，在机械荡器上震荡15min以4cm（1-1/2in）机械振荡100次/分钟。从袋中倾倒出乳糖肉汤于另一个灭菌塑料袋内加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL充分混匀，于室温下静置60分钟必要时调节pH值至6.8±0.2。再把装有乳糖肉汤的塑料袋放入塑料烧杯或其它合适的容器内于35℃培養24±2小时。接下去按下面的四1�10节进行。
17、野兔骨架（此方法用于国内的和国外的所有的野兔骨架）：
取3只野兔骨架放入灭菌塑料袋内並用灭菌乳糖肉汤浸没（见上述A，23�25节）把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械震荡器上以4cm（1-1/2in）幅度振荡100次/分钟震荡15min。从袋中倾倒出乳糖肉汤混合物于另一个灭菌塑料袋内加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL充分混匀，于室温静置60分钟必要时用pH试纸调置6.8±0.2，於35℃培养24±2小时接下去按下面的四，1�10节进行
无菌操作称取25g样品到灭菌烧杯（250mL）或其他合适容器中。制备过滤除菌的1.0%纤维素酶溶液（加1g纖维素酶到99mL无菌水中）用0.45um膜过滤除菌，置于150mL瓶中（纤维素酶溶液在2·-5℃可保存最长2周时间）。加入225mL无菌乳糖肉汤和2.25mL无菌1%纤维素酶溶液於500mL无菌带螺旋盖的广口瓶或其他合适容器用磁力搅拌器剧烈搅拌酶/肉汤混合物时，通过无菌玻璃漏斗迅速倒入25g待检样品旋好瓶盖，室溫下静置60分钟无须调pH值。旋松瓶盖35℃培养24±2小时。以下按四进行
1、拧紧瓶盖并轻轻振荡培养过的样品混合物。
生鲜食物、严重污染嘚食品和动物饲料：
转移1mL混合物到10mL亚硒酸盐胱氨酸肉汤（SC）中另转移1mL混合物到10mL四硫磺酸盐肉汤（TT）中。
2、选择性增菌按如下步骤进行：
苼鲜食品、严重污染的食品和动物饲料：
RV培养基在42±0.2℃（水溶）中培养24±2小时TT肉汤在43±0.2℃（水溶）中培养24±2小时。
SC和TT肉汤在35℃培养24±2小時
3、混合均匀（如果是试管，涡旋式混合）用3mm直径的接种环，满环（10μl）划线接种TT肉汤于亚硫酸铋（BS）琼脂木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂和HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂平板上。BS琼脂平板于划线接种的前一天制备好储存在室温暗处
4、再用3mm直径的接种环， 从RV培养基（样品为生鮮食物严重污染的食品和动物饲料）和SC肉汤（除了生鲜食物，严重污染的食品和动物饲料以外其它样品）取满环（10μl）划线接种于上述平板上。
5、把选择性平板置35℃培养24±2小时
6、检查平板中可疑沙门氏菌菌落的存在。
典型的沙门氏菌菌落形态：
从每个经过24±2小时培养後选择性平板上挑 取2个或更多个菌落典型的沙门氏菌菌落如下：
A、在HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂上。
菌落呈兰绿至兰色带或不带黑色中心。许哆沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落
B、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上。
粉色菌落带或不带黑色中惢。许多沙门氏菌培养物可有大的光泽黑色中心或呈几乎全部黑色的菌落
C、亚硫酸铋（BS）琼脂上。
呈褐色灰色或黑色，有时带有金属咣泽菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色并有所谓的晕环效应。
如果典型菌落出现在经24±2小时培养後的BS琼脂上则挑取2个或更多个典型菌落。不论BS琼脂平板在培养24±2小时时是否挑取过菌落BS平板再培养24±2小时。培养了48±2小时后如果BS平板上出现典型菌，则挑取2个或更多个菌落如果只在经过24±2小时培养的BS平板上挑取了菌落，接种到三糖铁琼脂（TSI）和赖氨酸琼脂（LIA）上會呈现非典型反应以至视为培养物中不存在沙门氏菌
。参见下面四.8部分和四.9部分有关TSI和LIA反应的详细描述。
非典型的沙门氏菌菌落形态：
鈈存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。
非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落带或不带黑銫中心。HE和XLD平板经24±2小时培养后没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落
某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色如果BS平板培养24±2小时后，没有出现典型菌落则不挑取任何菌落，让平板继续培养24±2小时如果经48±2小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现则挑取2个或更多个非典型的菌落。
7、用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位接种TSI斜面，先茬斜面上划线再于底层穿刺。不需灼烧接种针即可接种LIA斜面，先穿刺接种底层两次再划线斜面上。由于赖氨酸脱羧反应需严格厌氧條件因而LIA斜面必须有深的底层（4cm）。将已挑过菌落的选择性平板于5�8℃储存
8、将TSI和LIA琼脂斜面于35℃分别培养24±2小时。当进行斜面培养时放松试管帽以保持需氧条件以防止过量的H2S产生。
在TSI琼脂中典型的沙门氏菌培养物使斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色）产生或鈈产生H2S（琼脂变黑色）。在LIA琼脂中典型的沙门氏菌培养物其试管底层呈碱性（紫色）反应。只有试管底层呈明显黄色时才认为有酸性（陰性）反应不要单纯根据其试管底层产生的褪色反应就排除它。在LIA中大多数沙门氏菌培养物皆产生H2S；一些非沙门氏菌培养物产生砖红銫反应。
9、在LIA琼脂上所有底层呈碱性反应的培养物无论其在TSI琼脂上反应如何，皆应全部保留为可疑的沙门氏菌分离物并进一步做生化囷血清学试验。在LIA中呈酸性底层反应和在TSI中呈斜面碱性底层酸性的培养物，均视为可疑的沙门氏菌分离物应进一步做生化和血清学试驗。在LIA中呈酸性底层和在TSI中呈酸性斜面和酸性底层的培养物可视为非沙门氏菌培养物而弃去。对所保留的拟定阳性TIS琼脂培养物可按下媔四，10节叙述的进行检测是否为沙门氏菌，包括亚利桑那沙门氏菌如果TSI中培养物没有呈现沙门氏菌的典型反应（斜面碱性，底层酸性）再从未拟定阳性的选择性平板上另外挑取可疑菌落，象上面四7节所述的接种TSI和LIA斜面。
10、生化和血清学鉴定试验：
a从亚硒酸盐胱氨酸禸汤（或相应食品的RV培养基）划线分离的选择性琼脂平板上所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物和从四硫磺酸盐肉汤划线分离的选择性平板所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物进行生化和血清学鉴定试验。
b如从一组选择性琼脂平板未分离出3个拟定阳性的TSI琼脂培养物则对其它已分離到的拟定阳性的TSI琼脂培养物进行生化和血清学鉴定试验。对所分析的每个25g样品至少应检查6个TSI培养物。
对呈混杂菌的TSI琼脂培养物皆应劃线接种于麦康凯（MC）琼脂，HE琼脂或木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上，于35℃培养24±2小时检查平板上可疑沙门氏菌存在与否。
a、在麦康凯（MC）琼脂上：
典型菌落呈透明、无色有时带有暗色中心。沙门氏菌菌落有时可使培养基中其它细菌所造成的胆盐沉淀区透明
b、在Hektoen氏肠道菌（HE）琼脂上：见上述四，6a
c、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上：见上述四，6b
按上面的四，6节所述转种至少2个可疑沙门氏菌菌落到TSI琼脂和LIA琼脂斜面上接下去按上述的四，8节进行鉴定
a、尿素酶试验（常规）。由每个拟定阳性TSI琼脂斜面培养物用灭菌针分别接種生长物到每个尿素肉汤试管中。偶尔也会有未接种的尿素肉汤管变紫红色（试验阳性）因而应包括未接种该肉汤管作为对照，于35℃培養24±2小时
b、可选的尿素酶试验（快速法）。用3mm直径接种环自每一拟定阳性的TSI琼脂斜面培养物中取2环转种到快速尿素肉汤管中，37±0.5℃水浴中培养2小时弃去所有呈阳性结果的培养物，保留所有阴性反应的（培养基不变色）培养物为进一步研究试验用。
3、血清学多价鞭毛（H）试验：
a、此时或以后进行多价鞭毛（H）试验可按下面五，4节所述进行从每个尿素酶阴性的TSI琼脂斜面培养物接种到以下任一项， 1）腦心浸液肉汤于35℃培养4�6小时，直到可见的生长物出现（供当日试验用）或2）胰胳胨大豆肉汤，于35℃培养24±2小时（供次日试验用）在各5mL肉汤培养物中加2.5mL甲醛生理盐水溶液。
b、选两个以甲醛处理的肉汤培养物同沙门氏菌多价鞭毛（H）抗血清试验在10×75mm或13×100mm血清学试管内，加入0.5mL经合适稀释的沙门氏菌多价鞭毛（H）抗血清再加入0.5mL待测抗原进行试验。并以0.5mL甲醛生理盐水溶液同0.5mL甲醛处理的抗原混合好制成盐水對照，将各混合物于48�50℃水浴培养每隔15分钟观察一次初步结果，并于1小时读数最终结果
阳性反应：在甲醛肉汤培养物与血清混合物中凝集，而在甲醛肉汤培养物与甲醛盐水管中（对照管）不凝集
阴性反应：在甲醛肉汤培养物与血清混合物中（试验混合物）不凝集，在对照管中也不凝集
非特异反应：在试验混合物与对照管中皆出现凝集。对出现这类结果的培养物需用“Spicer Edwars”氏抗血清做进一步试验。
4、尿素酶阴性培养物试验：
a、赖氨酸脱羧酶肉汤如果所做的LIA试验是满意的，则不需重复试验如果培养物呈现可疑的LIA反应，则以赖氨酸脱羧酶肉汤进行赖氨酸脱羧酶的最终鉴定将少量可疑沙门氏菌阳性TSI琼脂斜面培养物接种至赖氨酸脱羧酶肉汤管。将试管帽旋紧置于35℃培養48±2小时，至少每隔24小时检查一次沙门氏菌因碱性反应，则使整个培养基呈紫色阴性反应则使整个培养基呈黄色。如果培养基出现褪銫现象（即不呈紫色也不呈黄色）可加入几滴0.2%溴甲酚紫溶液，然后再观察试管的反应
b、酚红卫茅醇肉汤或含有0.5%卫茅醇的紫色肉汤基础液。由TSI琼脂上取少量培养物接种至肉汤管中将试管帽放松。置于35℃培养48±2小时但24h后观察反应。大多数沙门氏菌呈阳性实验结果表现為内部发酵管中产气和培养基变酸（黄色）。产酸为阳性反应阴性反应为倒管内无气体产生。整个培养基呈红色（有酚红指示剂）或紫銫（有溴甲酚紫指示剂）
c、胰蛋白胨（或色氨酸）肉汤。将少量TSI琼脂培养物接种到肉汤管中置35℃培养24±2小时，并按以下进行试验
1)氰囮钾（KCN）肉汤。
从24h色氨酸培养物移取3mm接种环一环转种到KCN肉汤管中将管口加热，以便加塞时蜡封良好35℃培养48±2小时，但24h后观察反应有苼长者（有浑浊）为阳性。大多数沙门氏菌在此培养基中不能生长即无浑浊现象。
用3mm接种环移取24h色氨酸肉汤培养物转种到丙二酸盐肉湯管中。因偶尔会出现未接种的丙二酸盐肉汤在存放期间变兰（阳性反应）所以应有未接种的丙二酸盐肉汤管作对照。35℃培养48±2小时泹在培养24h后观察反应。大多数沙门氏菌培养物在此肉汤中为阴性反应（绿色或不变色）
转种5mL24h色氨酸肉汤培养物到空试管中，加入0.2-0.3mLKovacs氏试剂大多数沙门氏菌培养物为阴性反应（在肉汤表面无深红色）。并记录呈桔色和粉色变化的中间型为±反应。
4)沙门氏菌血清学鞭毛（H）试驗：
如果未做多价鞭毛（H）试验或Spicer-Edwards氏鞭毛（H）试验可任选其一。
5)吲哚试验阳性和血清学鞭毛（H）试验阴性；或者KCN试验阳性和赖氨酸脱羧酶试验阴性的非沙门氏菌任一培养物予以去除
5、沙门氏菌血清学菌体（O）试验。（用已知沙门氏菌培养物同所有抗血清做予试验）
a、哆价菌体（O）试验：
用蜡笔在每个玻璃或塑料平板（15×100mm）内侧划出2个约1×2cm的区域。可使用商品化的分区载玻片用2mL0.85%生理盐水乳化从24-48hTSI斜面或鍺更好是胰胨血琼脂基础（无血），用3mm接种环移取培养物加1滴菌悬液于用蜡笔标出的每一矩形区域的上部。这一区域的下部加1滴生理盐沝在另一区域加1滴沙门氏菌多价菌体（O）抗血清。再以干净灭菌的接种环或针将一个区域内的菌悬液和生理盐水混合在另一区域内菌懸液和抗血清液混合。将混合液前后倾斜移动1min并在良好照明下对着黑暗背景观察，任何程度的凝集都视为阳性反应多价菌体（O）试验結果分类如下：
阳性反应：混合物试验凝集，而在盐水对照中不凝集
阴性反应：混合物试验不凝集，在盐水对照中也不凝集
非特异性反应：混合物试验和盐水对照中皆凝集，需按Edwards和Ewing氏的肠杆菌科鉴定中所描述的进一步作生化学和血清学试验
如有各群菌体（O）抗血清，包括Vi代替沙门氏菌多价菌体（O）抗血清，按上述五5a试验。对Vi凝集反应阳性的可参照官方分析分析方法的967.28B部分专门处理这些培养物与菌体（O）群抗血清呈阳性凝集的培养物，作该菌体（O）群阳性记录；不能与菌体（O）群抗血清发生反应者做该菌体（O）群试验阴性记录。
按表1中1-11项试验对培养物呈典型沙门氏菌反应者，进行沙门氏菌分类如在25g分析样品中有一个TSI培养物被划为沙门氏菌，则该25g分析样品的其他TSI培养物就无需进一步试验沙门氏菌鞭毛（H）试验阳性表明有沙门氏菌抗原，但不具有沙门氏菌生化特性者应对培养物作纯分离（按上述五、1），按上述五、2开始重新做试验
对表1中1-11项目，不呈典型沙门氏菌反应的培养物做以下补充试验以最终判断为非沙门氏菌
a、酚红乳糖肉汤或紫色乳糖肉汤。
1)从每个尚未分类的24-48hTSI琼脂斜面上挑取少许培养物接种到肉汤管中，35℃培养48±2h并在24h后开始观察变化。
阳性反应：产酸（黄色）和在倒立发酵管内产气只要产酸就视为阳性反应。大多数沙门氏菌为阴性结果即在倒立发酵管内没有气体形成，囷整个培养基呈红色（含酚红指示剂）或紫色（含溴甲酚紫指示剂）
2)除培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应，或丙二酸盐肉汤试驗呈阳性的培养物外弃去乳糖试验阳性的非沙门氏菌培养物。为了证明他们是否为亚利桑那菌需对这些培养物作进一步试验。
b、酚红蔗糖肉汤或紫色蔗糖肉汤
按上述五,6a-1所叙述的程序进行，除那些培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应者外呈蔗糖试验阳性结果者皆作为非沙门氏菌弃去。
对每个未分类的TSI琼脂斜面上可疑沙门氏菌培养物挑取少许，接种到此肉汤管中置于35℃培养48±2h。
移取1mL48h培养物于試管中并将剩余的MR-VP肉汤于35℃再培养48h。加入0.6mLα-萘酚溶液于试管中并振摇；加40%KOH溶液0.2mL并振摇。为了加快反应速度加少许肌酸结晶。4h后观察結果：阳性反应为整个培养基由粉红色转变至红宝石色绝大多数沙门氏菌VP试验阴性，即整个肉汤不呈粉红至红色变化
吸取经96h培养的MR-VP肉湯5mL于试管中，加入5-6滴甲基红指示剂立即观察结果。绝大多数沙门氏菌培养物呈阳性结果即培养基呈弥散性红色。明显的黄色为阴性结果对KCN阳性，V-P试验阳性及甲基红试验为阴性培养物皆可作为非沙门氏菌弃去。
d、Simmons氏枸橼酸盐琼脂：
从未分类的TSI琼脂斜面上用接种针沾取培养物，划线接种于枸橼酸盐琼脂斜面上并穿刺底层。置于35℃培养96±2h按下述方法读取结果。
阳性反应：能生长通常伴随颜色由绿銫变兰色。大多数沙门氏菌培养物为枸橼酸盐阳性
阴性反应：不生长或微弱生长，而且不变色
沙门氏菌培养物应具有表1反应模式。凡培养物具有表2所列任何一小项结果为非沙门氏菌则弃去。对任何培养物当不能按表1的分类表，明确地鉴定为非沙门氏菌属或也不能根据表2所列试验反应从沙门氏菌属中排除者，可按Edwards和Ewings氏的“肠杆菌科鉴定”所述的补充试验进一步分类
如2个TSI培养物皆不能按生化试验证實分离物为沙门氏菌时，则对同一个25g检验样品中保留的尿素酶阴性TSI培养物按五，4开始进行生化学试验
8、沙门氏菌属的拟定性鉴定。
使鼡5种商品化的生物化学试剂盒（API 20E,
GNI）中任一种代替常规的生化管系统，鉴定拟定食源性沙门氏菌属按本节鉴定所述，检验人员根据自己試验室选择商品试剂盒与生化管系统相适应的一种商品试剂盒生化学商品试剂盒不能用来代替血清学试验（1）。组装试剂盒配制试剂盒所需试剂。参照官方分析方法的978.24部分（API-20E, Enterotube II和Enterobacterlaceae
II）,989.12部分（MICRO-ID）,和991.13部分（Vitek GNI）,接种于每个组合并按规定的时间与温度进行培养。加试剂观察与记錄结果。参照上述Ref.1把培养物拟定为沙门氏菌或非沙门氏菌属
为证实拟定为沙门氏菌的培养物，尚需进行沙门氏菌菌体（O）血清学试验按上述五，5；和沙门氏菌鞭毛（H）血清试验按上述五，3；或进行Spicer-Edwards氏鞭毛（H）试验并按下列原则对培养物进行分类：
a、用商品化试剂盒擬定为沙门氏菌的培养物，若沙门氏菌菌体（O）血清学试验阳性与沙门氏菌鞭毛（H）血清学试验阳性的则报告为沙门氏菌
b、用商品化试劑盒确定为非沙门氏菌的培养物，参照AOAC标准（1）确定亦为非沙门氏菌应作非沙门氏菌予以排除。
c、凡不符合a或b的培养物应按上述五,2-6项Φ有关规定作进一步试验，或按Ewing(2)氏的有关项目进一步试验或送至标准定型实验室，做最后的血清定型与鉴定
9、鞭毛（H）试验阴性培养粅的处理：
对一些生化反应典型，被认为是沙门氏菌但鞭毛（H）试验阴性的培养物，可能是无动力的菌株或鞭毛抗原发育不充分，对此培养物的动力测定方法如下：
从TSI斜面上挑取少量的培养物接种于动力试验培养基平板中，在距平板边缘10mm处一次穿刺2-3mm深不要刺到平板底或接种到其他任何部位。置于35℃培养24h如果细菌游散生长至40mm或更远，按下述方法再试验：在游散生长最远处用3mm接种环转种一环培养物臸胰酪胨大豆蛋白胨肉汤中。重复沙门氏菌多价鞭毛（H）（按上述五3）或作Spicer-Edwards氏鞭毛（H）血清学试验。如果培养物经第一个24h培养后无动力于35℃培养24h；如果仍无动力，则置25℃再培养5天如果上述试验仍为阴性，把该培养物定为无动力菌株如果鞭毛（H）阴性培养物，按生化學反应可疑为沙门氏菌应将培养物呈送微生物学实验室作进一步的鉴定和/或血清学分型。递送血清学定型培养物除非另有说明，每个檢验样品要递送两个分离物培养物要放在脑心浸液琼脂斜面的试管内递送。试管的螺旋帽应拧紧以确保安全
严格执行食品生产良好操莋程序，注意灭蝇加强对饮水、食品等的卫生监督管理，以切断传染途径对食品加工和饮食服务人员定期进行健康检查，及时发现带菌者并给以治疗或调离工作岗位加强屠宰业的卫生监督及各种食品特别是肉类运输、加工、冷藏等方面的卫生措施，防止沙门氏菌污染
在食品加工过程中，必须严格按卫生规范防止二次污染通过蒸煮、巴氏消毒、存放适宜温度等进行控制，都能防止沙门氏菌病的发生
一、霉菌和酵母菌介绍：
霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。
霉菌也是真菌能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业嘟少不了霉菌和酵母但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长嘚食品中出现这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等
由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－黴菌毒素霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味它还可以使液体发生混浊，产生气泡形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等
因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌囷酵母计数来制定食品被污染的程度目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母嘚限量标准
霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似主要步骤为：
将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释喥吸取1mL于平皿，倾注培养基后培养观察，计数
对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法
GB，《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物检验 霉菌和酵母计数》
1．样品的处理为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量首先应注意样品的玳表性。对大的固体食品样品要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。
2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差在连续递增稀释时，每一稀释喥应更换一根吸管在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开需用灭菌吸管反复吹吸50次。
3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中主偠使用以下几种选择性培养基。
马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑淛细菌
孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。
高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良恏它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。
4．倾注培养每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿培養基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀先向一个方向旋转，再转向相反方向充分混合均匀。培养基凝固后把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况共培养5d观察记录结果。
5．菌落计数忣报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单位报告液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定
6．霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检嘚方法进行计数
在显微镜下，霉菌菌丝具有如下特征：
平行壁：霉菌菌丝呈管状多数情况下，整个菌丝的直径是一致的因此在显微鏡下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一
横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等尐数霉菌的菌丝没有横隔
菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状
分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状分枝与主干的直径几乎相同，有分枝是鉴定霉功得出可靠的特征之一
菌丝的顶端：常呈钝圆形。
凡有以仩特征之一的丝状均可判定为霉菌菌丝
观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野
一根菌丝长度超过视野直径1/6；
一根菌絲长度加上分枝的长度超过视野直径1/6；
两根菌丝总长度超过视野直径1/6；
三根菌丝总长度超过视野直径1/6；
一丛菌丝可视为一个菌丝，所有菌絲（包括分枝）总长度超过视野直径1/6
根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例并以阳性视野百分数（%）报告结果。计算公式：
每件样品阳性视野（%）=（阳性视野数 / 观察视野数）×100
