1、酶联免疫吸附实验 ELISA 操作规则（新手适用）一、实验目的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。二、实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物2、酶，碱性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)25，式中1指HRP百分浓度为100ml含酶蛋3、白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（einheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 （二）酶与底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。免疫技术常用的酶及其底物酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色494、2*四甲替联苯胺黄色460*氨基水杨酸棕色449邻联苯甲胺兰色4252，2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐蓝绿色642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)黄色400萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405，420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)荧光360，450硝基酚半乳糖苷(ONPG)黄色420* 终止剂为2mol/L H2SO4* 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。可催化下列反应： HRP+H2O2复合物 复合物+AH2过氧化物酶+H2O+A AH2 为无色底物， 5、供氢体； A 为有色产物。（三）ELISA常用的四种方法1直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；加底物。底物的降解量抗原量。 2间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加抗体， 形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。 测定底物的降解量抗体量。3双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 加底物。底物的降解量抗原量。4. 竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体表面;(1) 加入酶标抗原；(2)，(3)加入酶标抗原和待6、测抗原；加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。 三、仪器和材料1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板， 40， 96孔)。2. 酶联免疫检测仪3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG， 工作稀释度1:1000。4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4，保存，Na2CO3 0.15克， NaHCO3 0.293克，蒸馏水稀释至100 ml。5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS-Tween-20， ，保存. NaCl 8g， KH2PO4 0.2g， Na2HPO4.12H2O 2.9g， Tween20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。6. 洗涤液：同稀释液7、7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml)， 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O(7.163g/100ml)6.4ml， 蒸馏水12.5ml， 邻苯二胺10mg， 溶解后， 临用前加30%H2O2 40 微升。9. 终止液：2mol/LH2SO4。 四、操作步骤1.包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释， 一般为110微克/孔，每孔加200微升，37温育1小时后，4冰箱放置1618小时。2.洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。38、.加封闭液200微升，37放置一小时。4.洗涤同2。5.加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200微升。同时作稀释液对照。37放置2小时。6.洗涤同2。7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG， 每孔200微升， 放置37 1小时。8.洗涤同2。9.加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10-15分钟。10.加终止液：每孔50微升。11.观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤新手适用一、流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于9、一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN-COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。B-D公司最新产品为FACS V10、antage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICSALTRA和EPICSXL/XL-MCL。EPICSXL/XL-MCL和FACSCalibur是临床型;EPICSALTRA和FACSVantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。二、流式细胞仪主要技术指标 1.流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子，两个细胞间的荧光差5%即可区分。3.前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映11、被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2m.5m。4.流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。5.流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。三、流式细胞仪主要构造和工作原理-流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统光学系统信号检测与存储、显示、分析系统细胞分选系统。流动室（FlowCell或FlowChamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通12、过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60m、100m、150m、250m等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。图12.1流动室示意图(采自CoulterTrainingGuide)四、流式细胞仪13、主要构造和工作原理-激光光源及光束形成系统 流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488m，此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633m）和/或紫外激光管。流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22m66m)，在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。五、流式细14、胞仪主要构造和工作原理-光学系统 流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类：长通滤片（LP）-只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片(SP)-只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片(BP)-只允15、许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT)，如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525，接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575，接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。六、流式细胞仪主要构造和工作原理信号检测系统 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号，散射光分为前向角散射（ForwardScatter，FS）和侧向角散射或900散射（SideScatter，SS），散16、射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种，一种是细胞自发荧光它一般很微弱，一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光，荧光信号较强，这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由，以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。前向角散射（FS）反映被测细胞的大小，它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，它由一个光电倍增管(PMT)接收并转变为电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬17、盘或软盘内。流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，他们分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管，它的发射光波488m，氦氖离子气体激光管发射光波长633m)。488m激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是：激发光波长（m）发射光峰值（m）FITC488525（绿）PE488575（橙红）PI488630（橙红）ECD488610（红）CY5488675（深红）P18、reCP488675（深红）各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT)接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。七、流式细胞仪信号存储、显示、分析系统 (一) 信号存储存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以Listmode(列表排队)方式存入的，采用Listmode方式有两大优点:节约内存和磁盘空间易于加工处理分析。（二）信号显示和分析由于Listmode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直方图(图12.3)、二维点阵图(图12.4，12.5)、等高线图(图12.8)和密度图(图12.7)。1单参数数据显示和分析19、细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示，图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵坐标表示细胞数。见图12.3一维直方图，图中横坐标是FITC荧光信号相对强度值（对数），纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）。2.双参数数据显示和分析细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。如图12.4二维点阵图，是正常人外周血白细胞的前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细20、胞、粒细胞很明显地分为3群，可以很容易地圈“门”（Bitmap，无定型门），分析各亚群细胞的数据;图12.6假三维地形图(X轴:SSC，Y轴:FSCZ轴:细胞数)更清楚地表明这一点。图12.5二维点阵图是细胞的两种荧光（FITC和RD1）双参数数据显示，横坐标和纵坐标均是对数的，横坐标代表FITC，纵坐标代表PE，图中已设定适当的“门”（十字门），十字门的D1、D2、D3、D4门分别代表PE单阳性细胞、PE和FITC双阳性细胞、阴性细胞、FITC单阳性细胞。仪器的计算机就会给出两种荧光测定值（包括阴性细胞%、两种荧光各自的阳性细胞%、两种荧光的双阳性细胞%、各群细胞的平均荧光强度）。图12.721、和图12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数数据的密度图和等高线图，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定十字门就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。3三参数数据显示和分析细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C-、A+B-C-、A-B+C+、A-B+C-、A-B-C+、A+B-C+、A-B-C-）。见图12.9prism，22、图12.9为人外周血淋巴细胞亚群测定结果的分光图，图中给出CD3、CD4、CD8组合的各种结果，如T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-）为42.0%，如T抑制细胞（CD3+CD4+CD8-）为17.4%。图12.5两种荧光的二维点阵图(采自CoulterOperatersGuide)图12.7.双参数数据的密度图(采自CoulterOperatersGuide) 图12.6假三维地形图和二维点阵图(采自CoulterOperatersGuide)图12.8双参数数据的等高线图(采自CoulterOperatersGuide)图12.9分光图（prism）八、流式细胞仪主要构造和工作原理-细胞分23、选系统 如在细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动，使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中，不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中，从而实现了分选。分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。九、流式细胞仪的简易样品制备和操作步骤活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第24、二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。(一)操作步骤 特别简单制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)用10FCSRPMI1640调整细胞浓度为51010ml取40l细胞悬液加入预先有特异性McAb(550l)的小玻璃管或塑料离心管，再加50l 120(用DPBS稀释)灭活正常兔血清4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm5min弃上清，加入50l工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm5min加适量固定液(如为FCM25、制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100500l固定液)FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存57天)(二)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。3.10 FCS RPMI1640， DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。(三)注意事项有二种标记方式：直接免疫荧光标记法，直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直26、标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。间接免疫荧光标记法，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。1.整个操作在4下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗27、相结合，出现假阴性。3.最小化非特异性结合的方法a荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。b细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。c在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。加适量正常兔血清也可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性d在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一28、抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。e使用F(ab)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受29、体决定的背景影响已不再重要。f其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。附:1. DPBS (10， 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNaHPO 11.5g 临用时用蒸馏水110稀释KHPO 2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5)4NaN50ml (终浓度0.2)固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2)甲醛10mlNaN0.2g (终浓度0.02)免疫荧光（IF）细胞化学染色方法一、标本30、制作 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。二、荧光抗体染色方法（一）直接法1染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。2洗片倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。3用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.09.5）甘油封固、镜检4对照染色正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。染色抑制试验（一31、步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。类属抗原染色试验，前面已作叙述。直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。（二）间接法（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体32、。（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。对照染色：抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。阳性对照。间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。滴加未标记的特异性抗原作用切片于37，30min。缓冲盐水洗233、次，每次5min，吹干。滴加特异性荧光抗体再用切片于37，30min。如水洗。缓冲甘油封固，镜检。间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。（三）补体法1材料（1）免疫血清60灭活20min，用Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测34、定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。2方法步骤（1）涂片或切片固定。（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。（4）滴加经过适当稀释35、之抗补体荧光抗体30min，37，水洗同（3）。（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。3对照染色（1）抗原对照。（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。（3）灭活补体对照：将补体经5630min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。（四）膜抗原荧光抗体染色法本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细36、胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS（流式细胞术）即采用此法原理。（五）双重染色法在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：1一步法双染色 先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。2二步法双染色 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。（六）荧光抗体再染色法若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。37、有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。三、荧光抗原染色法某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。免疫组化操作规程石蜡切片(新手适用)（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3m38、mol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml。4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml。5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇- H2O39、2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.09.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复（1）高压热修复 40、在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95左右，放入组织芯片加热1015分钟。（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔510分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-241、，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。 2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37，切片也预热至37，消化时间约为530分钟；胃蛋白酶消化37时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，42、LCA，LN等。抗原修复注意事项：1）载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用PES、Poly-L-Lysine等试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留2030秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。1.2 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分43、钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。2）常用酶消化：2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%0.1%，消化时间为37、1040分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37、30180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为210g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。m3）抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可44、选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.00.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在9298之间并持续1015分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求45、）。取出容器，室温冷却1020分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热56分钟后），计时12分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟3，下接免疫组化染色步骤。3.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容46、器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达9298起开始计时1520分钟，然后端离电炉，室温冷却2030分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3、免疫组织化学染色 SP法SABC法1）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗23次各5分钟； 5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加抗50l，室温静置1小时或者4过夜或者371小时。9）4过夜后需在37复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加47、抗4050l，室温静置，或371小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加抗，室温1小时或者4过夜或者371小时（4过夜后在37复温45分钟）。8)PBS洗48、三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗，203720分钟。10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂SABC，203720分钟。12)PBS洗4次每次5分钟。13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。免疫组化中抗原修复技术的应用及注意事项福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影49、响免疫组化染色结果的基本因素。抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，建立在Fraenkel-conrat等人1一系列生物化学研究，经1991年shi等人2发展。抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施。本文的目的是概述AR-HIC的发展、应用和标准化。一、AR技术加热AR技术微波加热方法50、. 在传统标准方法，经脱蜡、脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧(化)物酶，石蜡切片经蒸馏水冲洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用微波炉加热5或10分钟（注意防止切片干躁）。有时在加热5分钟后，间隔1分钟，再加热5分钟（在第一个5分钟后检测液体高度）。加热后，从微波炉取出塑料Coplin缸，冷却15分钟。片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟，才进行IHC染色。为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。微波（MW）加热过程如下：在专51、用盒内放入200ml柠檬酸缓冲液（PH6.00.1），并盖上带有小孔的盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，有作者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率800W3，微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(根据目前的研究，建议用医用微波炉)，中档继续处理10-20分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次3分钟。尽管有少数作者4认为经高温后冷却这一步省略。在我们观点，15分钟的冷却必须的几点理由：1、如这一步省略，对于有些抗体而言，会降低AR-IHC染色强度。2、突然从高温到低52、温可导致组织片掉片。3、可能引起形态学的变化。 单纯加热方法. 将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中，置电炉（600W）上加热至沸腾，并持续10min 。Shi等人2用单纯加热方法与微波加热方法比较IHC染色强度，显示两种方法导致相同的染色强度。高压加热方法. Shin等人5发展了含水高压锅煮沸方法，来增强福尔马林固定的脑组织tau蛋白免疫反应性。将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续2min，压力锅离开热源，加热长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟，时间过长可能会使染色背景加深。现试剂公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法，53、这几年的实践表明，采取此方法可避免假阳、阴性，使IHC染色效果更佳。非加热AR技术非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键，修复抗原。胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05或0.1PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可；或由迈新提供的0.125%的液体胰酶。将切片放入湿盒内37oC温箱中消化18-20分钟。 胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4的胃蛋白酶；链霉蛋白酶消化法 . 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1，消化时间20min。抗原修复的方法选择54、，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、F等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。 总之，以高压加热方法、微波加热方法较为稳定， 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸55、缓冲液和Tris-HCL较常用。前人的研究表明，温度高修复时间短6。解放军第251医院根据临床病理诊断、鉴别诊断和研究的实际需要，在抗原修复方法规范研究和应用的基础上，创用了胰蛋白酶尿素联合消化技术、盐酸水解暴露抗原技术和MW表面活性剂Triton X100（MWTX）修复抗原技术 7 。抗原暴露或抗原修复方法较多，其中发MW枸橼酸缓冲液使用较多，效果最好。MW修复抗原的方法是石蜡切片脱蜡、水洗后放入修复液中，用250W的输出功率2X5min，待冷却至室温按常规处理。目前AR过程已成功应用在BioTek全自动免疫组化染色仪中。二、AR应注意的问题加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，AR液的PH值、浓度、化学成分也是重要的影响因素之一。使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准9。Shi等人10强调修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要，实验中我们也发现要获得满意结果必须选择抗原修复液的最适PH值。在常规石蜡切片做AR-IHC，采用不同浓度的Alcl3液做AR液，发现4%的Alcl3取得最理想的染色11。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。郑辉等人12使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L Tris-HCL缓冲液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修复抗原，发现其阳性强度逐渐增强。高温抗原