高温胁迫下SA与蛋白质含量变化关系的研究&
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石河子大学
大学生研究训练计划项目申请书
高温胁迫下SA与蛋白质含量变化关系的研究
农学院园艺系
园艺2008-2
申请人电话
申请人E-mail
导师所在单位
石河子大学农学院
石河子大学教务处
二○○七年十月制
一、申请人简况
农学院园艺系
专业、年级
园艺2008-2
高温胁迫下SA与蛋白质含量变化关系的研究
1.&申请人参加科研工作简历
担任的工作
三下乡社会实践
2.&申请人入校以来的主要专业必修课成绩
气象学教学实习
计算机设计程序基础
3.&申请人入校以来获奖情况
励志奖学金
石河子大学
石河子大学
4.&项目组其他成员（不包括导师）
专业、年级
园艺2008-2
处理的实施
园艺2008-2
材料的培养
园艺2008-2
蛋白含量的测定
园艺2008-2
SA含量的测定
注：此表用A3纸打印一式三份，批准后由教务处、学院及申请人各保存一份。项目编号由教务处统一编号。
二、申请人对研究项目简要说明
（一）立论依据（项目的研究意义、拟研究问题的国内外现状分析、所涉及的学科领域、科学价值）
高等植物在生长发育过程中经常受到不良环境的胁迫，在胁迫因子中，高温常常是引起作物大面积减产和品质变劣的主要因素之一。近年来，随着温室效应的加剧，全球气温上升，植物生产面临着高温胁迫的严峻挑战。
新疆是典型的大陆性气候，夏季高温常给葡萄生产带来严重的经济损失。近几年，新疆果树生产发展很快，根据新疆农业&十一五&规划，葡萄栽培面积还将进一步扩大。因此，在高温干旱条件下，如何保障大面积的葡萄优质丰产就显的特别重要。因而，进一步研究高温环境对植物生命过程影响的作用机理对保证果树丰产优质有重要的现实意义和理论意义。
水杨酸（Salicylic&Acid,SA）即邻羟基苯甲酸，是一种简单的酚类化合物，参与植物的许多生理过程。它可以长距离运输,并作为一种胞内信号物质参与多种生理过程，被认为是提高植物抗逆性的信号分子。目前已有不少关于SA能提高植物抗性的报告。
1.高温逆境对植物体内蛋白合成的影响
在热胁迫过程中，植物体对高温胁迫的响应并不是被动的，会发生相应的响应来降低胁迫造成的伤害，以维持基本代谢，甚至通过开启某些基因的表达对高温产生抗性。如果植物生长的温度增加超过一个特定点，蛋白质合成的能力会出现突然下降。另一方面，增温会使编码热激蛋白质(HSPs)的热激mRNA的转录及选择性转译发生变化。遇高温胁迫时,植物细胞在分子水平上最突出的反应是热激蛋白的表达,其中小分子热激蛋白(sHSP)是主要热激表达产物,&sHSP可以可以与mRNA结合形成热激颗粒，从而保护这些mRNA在热激胁迫下不受伤害,所以sHSP被认为是提高植物细胞抗热能力的重要原因之一。HSPs中的绝大部分属于监护蛋白，它们是一类辅助蛋白分子，主要参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位，以及变性蛋白的复性和降解。HSPs通常可分为两类:高分子量HSPs(60-110KD)和低分子量HSPs(15-30KD)。由大的基因族编码的低分子量HSPs在植物中最为常见。在成熟的营养组织中，在最理想的生长条件下，植物小HSPs是检测不到的，但在超过正常温度10℃-20℃的热胁迫情况下，由于对热的反应，它们会迅速积累。实际上，在热胁迫叶片中，小HSPs可以积累到超过蛋白质总量的1%，并且它们在热胁迫之后还能持续很长时间，半衰期超过24小时。在许多有机体中，HSPs的累积与耐热性的发展有暂时的相关性，但目前人们对HSP在植物中的功能还了解很少。已有的研究证明，一些低分子量HSPs被转移到植物体的叶绿体中，能与光合膜结合在一起，潜在地保护了光合器官免受高温的伤害。最近的一些资料显示，一些HSPs起着&分子伴侣&的功能。&分子伴侣&是结合到部分折叠的或变性的底物蛋白质上的蛋白，因此能阻止不可逆的聚合或促进底物(基质)的正确折叠。底物结合到&伴侣&上还可以将底物保持在一个展开的构象，这有助于蛋白质越过膜进行易位及其它进程。有学者指出，在高温胁迫期间，HSPs可防止热变性蛋白质聚集体的累积，或者促进蛋白质在胁迫之后再生。虽然文献报道已很多，但植物适应高温的机制尚不清楚，有待于深入探讨。
（二）研究目标、主要内容、主要方法、拟解决的关键问题、预期目标及其研究成果和形式
（三）研究的进度安排
（四）研究工作已有基础条件
2.水杨酸与植物的抗热性关系
水杨酸&(salicylicAcid，sA)是植物防卫反应的重要内源信号分子,在植物抵御生物性胁迫中发挥重要作用。水杨酸(SA)作为一种介导植物产生系统获得性抗性(System&acquired&resistance，SAR)的小分子信号物质己经得到广泛证明。许多学者对植物在逆境条件下所产生的抗性与SA的关系进行了研究。Dat等利用芥菜幼苗研究的结果表明:用100-500&mol/L的SA处理后，能显著提高芥菜苗在55℃的热击条件下耐受1.5h，并且这种作用具有一定的浓度依赖性，但是，更高浓度的水杨酸并未诱导产生更强的高温耐受性。对这种现象的进一步研究，发现SA能够诱导植物体内积累更多的H2O2，与此同时，植物体内CAT的活性显著下降。Dat等另外的研究结果表明:芥菜在高温处理lh后，体内葡萄糖基SA增加了5.5倍，6h后开始下降。而游离态的水杨酸增加了2.2倍，但没有达到显著水平。Lopez-Delgado等将马铃薯的组织在含有SA的培养基中进行培养后，能够显著提高马铃薯组织的抗热性。
3.水杨酸和蛋白质合成的关系
SA还可以诱导某些相关蛋白的合成。SA&诱导蛋白质的合成目前主要集中于SA对病程相关蛋白(PRs)诱导的研究。最早在1979年，White研究发现，SA能诱导植物产生病程相关蛋白(PRs)。后来的许多的研究都证明，SA可以诱导植物产生某些PRS。Ward等发现，在接种了TMV的烟草叶片中有13种PRs基因表达，包括POD、酸性和碱性PR-1至PR-5蛋白及某些未知蛋白，末被接种TMV的叶片中，只有其中的9种基因表达，外施SA可同样诱导这9种基因表达，因此，可以看出外源SA诱导的PRs与植物染病后所产生的SAR时所形成的PRs是一致的。PRS是小于100KD的低分子量蛋白质，其前体含有信号肽，一般来说，酸性PRs多分布于细胞间隙，碱性PRs多分布于液泡中。许多PRS具有&-1，3一葡聚糖酶活性和几丁质酶活性，它们可以降解葡聚糖和几丁质。现在认为PRPs的产生是植物诱导抗病性的生化机制之一。SA还能够诱导POD同工酶的合成及蛋白激酶。王利军和黄卫东研究发现葡萄叶片经SA处理后至12h时，65.5kD的多肽表达量增加，而30kD的多肽表达量减少;至24h时，又有18kD的特异性多肽得到表达。这一现象非常类似于葡萄经38℃高温锻炼lh和3h后所出现的结果。至于SA能否诱导其它蛋白质的合成尚未见报道。
&&&&基于高温胁迫下外施水杨酸后，植株体内水杨酸含量升高，抗热性增强，蛋白质含量发生变化，我们立项研究高温胁迫下外源水杨酸对葡萄植株体内源水杨酸含量与蛋白质含量的变化以及二者相互的关系，从而进一步明确水杨酸在高温胁迫下对植物的抗热性所起到的作用及其与蛋白质含量之间的关系。
（二）研究目标、主要内容、主要方法、拟解决的关键问题、预期目标及其研究成果和形式
1.主要研究内容包括：
1.1经过不同时间的高温胁迫，葡萄植株体内总蛋白质含量和水杨酸含量的变化；
1.2外施水杨酸经过不同时间处理后，葡萄植株体内总蛋白质含量和水杨酸含量的变化；
1.3水杨酸预处理后，经过不同时间的高温胁迫，葡萄植株体内总蛋白质含量和水杨酸含量的变化以及二者相互关系研究；
2.研究目标：
通过研究从而进一步明确水杨酸在葡萄经过高温胁迫后所获得的抗热性中所起到的重要作用。
3.主要方法
3.1以营养繁殖、生长健壮、无病虫害、整齐一致的一年生葡萄苗为试材，进行不同时间和外施水杨酸处理，以常温条件和喷布蒸馏水为对照；
3.2样品中游离态和结合态水杨酸含量采用Palva（1994）提出的方法进行测定；
3.3样品中蛋白提取液的制备采用Zhang和Klessing（2001）提出的方法进行；
3.4蛋白提取液中蛋白含量测定采用Bradford（1976）考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白为标准蛋白；
4.实验中关键性的问题：
4.1工作量相对来说较大，为了保证实验的顺利进行，严格按照研究的进度安排进行实验操作；
4.2实验过程中需要用到的实验室较多，要及时和导师沟通协调。
5.本课题研究预期目标及研究成果和形式
5.1通过研究从而进一步明确水杨酸在葡萄经过高温胁迫后所获得的抗热性中所起到的作用；
5.2培养严谨的科研态度，撰写一篇达到省级以上学术刊物发表的论文。
（三）研究的进度安排
1.0.3&&实验资料的查阅，实验方案的完善；
2.0.7&&实验处理的实施；
3.0.11&&实验数据的整理和分析
4.2010.12&&&&&&&&实验结题材料的准备，实验结果的报道。
（四）研究工作已有基础条件
1.试验材料：石河子垦区及石河子大学农学院试验站有多个葡萄品种，并且具有培养优质实验苗木的温室条件，本保证实验所需材料；
2.技术指导：对于实验相关内容已经查阅了大量的文献资料，基本了解了本研究内容的实验方法，且指导老师具备该方面较为扎实的理论基础和实验技能，较为了解本实验相关内容的研究动态和方向，可以为本实验的顺利进行提供了很好的技术指导；
3.理论来源：大学图书馆及院图书馆都可以为我们提供这方面的详尽资料。
4.实验分析及处理：农学院植物生理实验室的人工气候培养箱可以为我们提供胁迫条件；石河子大学农学院园艺系实验室可以进行蛋白质含量的测定；动物科技学院的高效液相色谱仪可以进行水杨酸含量的测定。
三、申请资助金额和经费预算
资金总额及来源（单位：元）
共计（元）
申请学校资助（元）
院系配套资金（元）
自筹经费（元）
预算支出科目
支出金额（元）
预算根据及理由
实验材料培养地点的调查选择等
2．图书、资料费
相关资料及书籍的购置
3．实验材料费
实验分析所需要药剂的购置、实验地的租用等费用
4．测试、分析费
蛋白质提取、纯化分析及SA测量所需要的仪器使用费
5．复印、打印费
相关材料的复印、打印费用
上面未包括的其他费用
四、指导教师简况及工作
园艺2008-2班主任
园艺植物栽培与生理
农学院园艺系
石河子大学农学院园艺系
指导教师对课题设计的评价及指导工作方案：
该课题选题结合新疆实际，难易程度适中，工作量偏大。学生能够根据课题研究意义及国内外研究现状独立查阅文献资料，并设计出本课题的研究内容、方法和目标。试验方案设计合理，可操作性强，试验结果具有较高的理论价值。
本人会对本课题关键技术进行指导，积极联系实验所需仪器，保证实验的顺利进行。
指导教师（签字）：&&&&&&&日
五、申请人所在学院初审意见
对课题设计的科学性、可行性及指导教师工作方案的评审意见：
　院大学生研究训练工作组组长（签章）：&&&&&&&&&&&&　年&　月&　日Keywordsintronic microRNA, alternative splicing, heat stress, miRNA cropping, splicing signal, branch site, RNA silencing
全文下载：
&&&&&&&&各种生物胁迫（如病原菌的侵染）和非生物胁迫（如干旱、高温等）严重影响和威胁了植物的整个生长发育过程。在各种自然灾害中，干旱与高温是世界范围内最严重、最普遍的两种环境胁迫。干旱、半干旱地区遍及50多个国家和地区，总面积占到陆地面积的1/3，而我国将近一半的国土面积属于干旱、半干旱地区。近年来，全球遭受干旱胁迫和高温胁迫的范围逐步扩大，对植物的影响亦愈加严重。植物在长期进化过程中建立了一系列适应各种生物和非生物胁迫的机制，现在已有实验证据表明大量胁迫响应基因参与了植物抗逆过程，并且在这一过程中发挥关键作用。转录水平调控是基因表达调控的主要形式；基因首先通过pre-mRNA剪接，内含子移除，外显子拼接等一系列过程加工成mRNA；然后经过翻译加工修饰后形成完整的功能蛋白。可变剪接可以通过选择同一mRNA的不同位点，采用多种剪接方式进行加工，产生多种剪切变体，进而增加整个基因组转录和翻译水平的多样性。目前，许多报道发现环境胁迫直接影响了植物抗逆过程重要基因的正常剪切和基因表达，在转录水平进行调控。MicroRNA（miRNA）是真核生物中普遍存在的一类内源具有调控功能的非编码小RNA，通过碱基互补匹配结合下游靶基因mRNA，在转录后水平和翻译水平介导靶基因的沉默。近些年来，研究人员发现miRNA参与了生物体生命活动的多个步骤：包括染色体的形成、RNA的剪切和修饰、转录、mRNA的稳定、蛋白质的翻译转运等。miRNA同时响应外界环境变化，直接参与并调控多种植物胁迫响应关键基因，在植物抵抗逆境胁迫方面扮演着重要角色。因此，研究逆境胁迫响应miRNA以及miRNA在植物抵抗逆境胁迫时的功能成为分子生物学的研究热点。但是对于miRNA如何响应逆境信号，完成自身胁迫应答调控机制的研究却少有报道。到目前为止，可变剪切作为一种广泛存在的转录后调控的重要机制，还没有直接证据表明其参与调控miRNA的表达。本研究以拟南芥为研究材料，发现并证明了逆境胁迫所触发的可变剪切调控了植物中miRNA的表达，主要的实验结果如下：1．胁迫响应miRNA的筛选和鉴定实验室利用生物芯片的方法筛选并鉴定了拟南芥中响应环境胁迫（低温、干旱、高盐）的miRNA。芯片结果显示14个miRNA受到胁迫处理时表达量发生明显变化，其中有10个、4个和10个miRNA分别响应高盐、干旱和低温胁迫。miR400作为一个来自于内含子，并且单一响应温度胁迫的miRNA，被选做进一步研究的对象。通过序列分析及反转录实验证明，miR400位于宿主基因5′末端的非编码区内，与宿主基因共同转录。GUS染色和活性测定结果与实时荧光定量PCR结果一致，表明各个组织器官中miR400与宿主基因共表达，说明二者位于一个转录单元内，共用同一个启动子。2．温度胁迫对miR400表达的影响实时荧光定量PCR和Northern杂交的结果显示，4℃低温处理诱导miR400前体与宿主基因表达，二者表达量随着低温处理时间延长逐渐增加。miR400的成熟体呈现同样表达趋势，说明在低温胁迫下miR400的积累可能由于转录水平增加导致。启动子染色与活性分析与推测结果一致，显示在低温胁迫条件下，整个基因转录水平的提高导致miR400与宿主基因表达量的增加。实时荧光定量PCR和Northern杂交分析结果显示miR400和宿主基因对高温胁迫处理表现出了不同响应趋势，miR400前体表达量在高温胁迫的条件下明显升高，同时miR400成熟体的表达量却明显减少；宿主基因在高温胁迫条件下表达量没有显著变化，说明高温胁迫对miR400和宿主基因的调控非常复杂，可能不是由单独的转录调节直接导致，推测miR400对高温胁迫响应的过程中还存在新的调控机制。3．高温胁迫触发可变剪切现象的分析半定量PCR检测结果表明，miR400前体所在的整个内含子存在一种高温胁迫特异触发的可变剪切现象。结果分析显示这种可变剪切随着高温处理的温度上升及持续时间增加而逐渐增加。剪切片段测序结果表明，内含子3′末端出现100bp碱基丢失，导致包含miR400前体在内的部分内含子区域保留在宿主基因5′端非编码区上，这种可变剪切现象的发生直接导致了miR400前体的积累。通过构建了不同表达载体来模拟可变剪切中出现的不同剪切产物，利用拟南芥稳定表达和本生烟草瞬时表达验证实验假设。实验结果表明，miR400前体能否从5′端非编码区上的内含子正常剪切，是miR400成熟体正常加工的关键。因此，我们认为在高温逆境胁迫影响下可变剪切是造成miR400表达量下降的主要原因。可变剪切不但造成miR400前体的积累，同时也是抑制miR400成熟体的表达。4．可变剪切信号分析及鉴定针对可变剪切抑制miR400表达， miR400所在内含子的序列分析表明，包括前体在内的miR400二级结构没有受到影响，仍然可以正常折叠形成成熟miR400。点突变实验结果表明，剪切信号的变化直接导致特殊条件下可变剪切的发生，通过检测整个内含子剪切信号发现，在可变剪切过程中片段的丢失影响剪切信号的精确识别。miR400所在内含子剪切信号的变化，影响原有内含子正常剪切，诱导可变剪切发生，进一步抑制miR400前体剪切及成熟体加工。5．miR400功能鉴定及可变剪切调控普遍性分析在高温胁迫处理条件下，miR400过表达转基因植株的萌发率，下胚轴，根长以及成活率明显低于野生型植株，这说明miR400在植物参与逆境胁迫过程中起着十分重要的作用。利用生物信息学工具，在拟南芥中发现并鉴定了17个位于基因内部的miRNA，分析结果表明8个miRNA可能直接受到可变剪切调控。在拟南芥亲缘关系最近的物种芸薹属代表植物中发现，miR400表达量在高温胁迫条件下明显减少，仍然受可变剪切调控。以上实验结果说明，可变剪切这一调控机制普遍存在于多种植物中。
&&&&Environmental stress factors seriously influence plant growth and development.Extensive agricultural losses are attributed to temperature, often in combination with droughtor other stresses. A number of genes were proved to be involved in plant responses to variousabiotic stresses. The regulation of gene expression is mainly controlled at the transcriptionallevel. Previous studies have indicated that AS (Alternative Splicing) is common in plants andcontributes to both transcriptome and proteome diversity. Several reports have shown thatvarious environmental stresses influence alternative splicing of pre-mRNAs, including somestress response genes.Recently, microRNAs (miRNAs), a class of~22nt noncoding RNAs, have emerged asregulators of gene expression through post-transcriptional degradation or translationalrepression through base pairing to target mRNAs. The discovery of large numbers of miRNAsand their diverse functions in both plants and animals has led to widespread agreement abouttheir importance. Several recent studies have shown that a number of stress-regulated genesencoding important transcription factors are targets of miRNAs. However, increasingevidence points to the important relationship between miRNAs and environmental stressresponses, but the regulatory mechanisms in plants are poorly understood. To our knowledge,no direct evidence of how stress-related AS regulates miRNA expression has been provided inprevious research.Here, a novel example is provided that stress-related AS could be a regulatorymechanism modulating the expression of intronic miRNAs. The findings of this study extendthe current view about the regulatory mechanism of miRNAs. The main results andconclusions presented in this thesis are as follows:(1) To understand the regulatory mechanism of the temperature affecting miR400expression, we performed various transcript analyses. Sequence analysis showed that miR400derived from the first intron of At1g32583in the5′UTR. Both the tissue pattern of GUSstaining and qRT-RCR analysis revealed that miR400was encoded in the intron of At1g32583 and was transcribed as a single unit in various tissues. Taken together, intronic miR400isco-transcripted with the hostgene in various tissues of Arabidopsis.(2) To investigate the relationship between miR400expression and cold stress inArabidopsis, we performed qRT-PCR and northern blot analysis. Increased levels of MIR400and host gene transcripts were apparent after8h of exposure to4℃and continued to increasewith prolonged (24h) exposure. The level of mature miR400was also upregulated by coldstress, suggesting that the accumulation of both MIR400transcripts and mature miR400wasdue to transcriptional induction in response to cold stress. Analysis of GUS activity andhistochemical GUS staining showed that cold Stress induced miR400and its hostgeneexpression mainly by increasing transcriptional activity.To further examine the miR400response to heat stress, we performed qRT-PCR andnorthern blot analysis using seedlings exposed to a temperature of37℃for12h. Surprisingly,expression of MIR400and its host gene displayed opposite responses to heat stress. Heatstress suppresses mature miR400expression but upregulates MIR400transcripts.(3) Intriguingly, we found pre-mRNAs underwent an alternative splicing event in the firstintron of the host gene downstream of MIR400transcripts under heat treatment. A100bpexcised fragment from the3′-end of the first intron was detected. Thus, we suggest that thedeletion of100bp fragments interfered with the splicing of the remaining region of the firstintron containing miR400, resulting in the accumulation of MIR400transcripts.To further understand how AS influences intronic miR400processing, we generated fourintronic miR400constructs to directly test the effects of the100bp excised fragments in theAS event. The results showed that AS-mediated regulation resulted in decreased miR400levels by holding the206bp retained intron with the primary miR400hairpin in the5′UTR ofthe host genes. We conclude that the100bp excised fragment appearing in the heat-inducedAS event is essential for the processing of mature miR400in Arabidopsis. Together,alternative splicing is the major factor for inhibiting mature miR400expression under heatstress.(4) To further understand how AS suppresses miR400expression, we performed adetailed sequence analysis of the first intron in the host gene. The results showed that the secondary structure of pri-miR400was not interrupted after the heat-induced AS event, whichcould be folded to enable processing of the miRNA when the holding intron is spliced out ofthe pre-mRNA. A typical branch point likely mediates normal processing of miR400. Wefound that the100bp fragment contained the original branch point from the3′-end of theexcised intron, whereas the remaining206bp intron was retained, indicating that the splicingsignals in the retained sequences were not sufficiently clear to be recognized as intronic.Thus,the recognition of the pre-mRNA branch point and associated sequences is essential fornormal processing of miR400.(5) To further characterize the biological function of miR400in heat stress, we generatedtransgenic Arabidopsis plants overexpressing miR400under control of the constitutive CaMV35S promoter. No phenotype differences were observed between the transgenic and wild typeplants under normal growth conditions. However, under heat stress,35S::MIR400seeds had alower germination percentage and germinated slower compared with the wild type seeds. Andthe less hypocotyl elongation of35S::MIR400seedlings indicated a defective in acquiredthermotolerance. Moreover, heat treatment also reduced the root growth of35S::MIR400seedlings. Together, these results revealed that overexpression of MIR400made the plantsmore sensitive to heat stress, suggesting that miR400might play a role in regulating theresponse to environmental stresses in plants.To date,17intronic miRNAs have been discovered in Arabidopsis. Sequence analysis ofthe introns containing miRNAs showed that eight miRNAs have potential alternative splicingisoforms, suggesting that the generation of other intronic miRNAs might be affected by ASevents triggered under specific conditions in plants (as in the case of miR400). AS acts as aregulatory mechanism for miRNA expression in response to environmental cues and wepropose that the insights gained from the characterization of miR400will be useful forstudying many other miRNAs present in eukaryotic genomes. Future investigations areneeded to determine whether AS might be involved in other intronic miRNA cropping inplants.
&&&&&&&&高温胁迫诱导的可变剪切调控植物MicroRNA加工的研究目录7-11中文摘要11-14Abstract14-161 前言17-44&&&&1.1 miRNA（microRNA）的发现及特征17-21&&&&&&&&1.1.1 miRNA 的发现17-18&&&&&&&&1.1.2 miRNA 的特征18-19&&&&&&&&1.1.3 miRNA 与其它小分子 RNA 的区别和联系19-21&&&&1.2 miRNA 的生物合成及加工21-24&&&&&&&&1.2.1 miRNA 的重要合成加工蛋白21-22&&&&&&&&1.2.2 miRNA 的合成过程22-24&&&&1.3 miRNA 的作用机制24-26&&&&&&&&1.3.1 靶基因 mRNA 的剪切降解24&&&&&&&&1.3.2 靶基因翻译水平的抑制24-25&&&&&&&&1.3.3 靶基因表观遗传学水平的调控25-26&&&&1.4 miRNA 对基因表达调控的作用26-31&&&&&&&&1.4.1 miRNA 对植物生长发育的调控26-27&&&&&&&&1.4.2 miRNA 对植物响应逆境胁迫的调控27-31&&&&1.5 miRNA 的自身调节机制31-34&&&&&&&&1.5.1 miRNA 加工复合体的调节31-32&&&&&&&&1.5.2 miRNA 自身反馈调节32-33&&&&&&&&1.5.3 miRNA 的模拟靶基因竞争调节33-34&&&&1.6 植物可变剪切的发现和特点34-35&&&&&&&&1.6.1 可变剪切的发现34&&&&&&&&1.6.2 可变剪切的特点34-35&&&&1.7 动植物 mRNA 剪切的序列特征35-36&&&&1.8 mRNA 剪切位点识别36-37&&&&1.9 可变剪切的种类37-38&&&&1.10 可变剪切过程中参与的重要蛋白38-39&&&&1.11 逆境胁迫影响可变剪切39-40&&&&1.12 miRNA 的可变剪切40-42&&&&1.13 本研究的目的及其意义42-442 材料与方法44-60&&&&2.1 实验材料44-45&&&&&&&&2.1.1 植物材料44&&&&&&&&2.1.2 菌株与质粒44&&&&&&&&2.1.3 酶与生化试剂44&&&&&&&&2.1.4 实验所用引物与寡核苷酸44-45&&&&2.2 方法45-60&&&&&&&&2.2.1 拟南芥基因组提取45-46&&&&&&&&2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化46&&&&&&&&&&&&2.2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备46&&&&&&&&&&&&2.2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的转化46&&&&&&&&2.2.3 小量碱法提取大肠杆菌中的质粒46-47&&&&&&&&2.2.4 农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备及转化47-48&&&&&&&&&&&&2.2.4.1 农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备47&&&&&&&&&&&&2.2.4.2 农杆菌 GV3101 感受态细胞的转化47-48&&&&&&&&2.2.5 拟南芥的遗传转化48&&&&&&&&2.2.6 转基因拟南芥的鉴定48&&&&&&&&2.2.7 转基因植物的 GUS 组织化学染色分析48-49&&&&&&&&2.2.8 GUS 活性测定49-50&&&&&&&&2.2.9 RNA 提取50&&&&&&&&2.2.10 RNA 中基因组 DNA 的去除50&&&&&&&&2.2.11 反转录合成一链 cDNA50-51&&&&&&&&2.2.12 Real-Time PCR 体系及反应条件51&&&&&&&&2.2.13 农杆菌介导的本生烟瞬时侵染51-52&&&&&&&&2.2.14 Northern 杂交分析52-54&&&&&&&&&&&&2.2.14.1 RNA 电泳52&&&&&&&&&&&&2.2.14.2 转膜52-53&&&&&&&&&&&&2.2.14.3 杂交53-54&&&&&&&&2.2.15 Small RNA 的提取54-56&&&&&&&&&&&&2.2.15.1 Small RNA 实验准备54-55&&&&&&&&&&&&2.2.15.2 Small RNA 分离步骤55-56&&&&&&&&2.2.16 Small RNA 的 Northern 杂交分析56-58&&&&&&&&&&&&2.2.16.1 聚丙烯酰胺尿素变性凝胶与样品的制备56-57&&&&&&&&&&&&2.2.16.2 Small RNA 电泳检测57&&&&&&&&&&&&2.2.16.3 Small RNA 转膜57&&&&&&&&&&&&2.2.16.4 P32-ATP 标记的寡聚核苷酸探针合成57&&&&&&&&&&&&2.2.16.5 用寡核苷酸探针检测小 RNA57-58&&&&&&&&2.2.17 Small RNA 的 qRT-PCR 分析58-60&&&&&&&&&&&&2.2.17.1 miRNA 第一链合成58-59&&&&&&&&&&&&2.2.17.2 Mature miRNA 荧光定量检测59-603 结果与分析60-95&&&&3.1 拟南芥中胁迫相关 miRNA 的筛选鉴定60-64&&&&&&&&3.1.1 利用拟南芥 miRNA 芯片鉴定胁迫相关的 miRNA60-61&&&&&&&&3.1.2 miR400 序列分析61-62&&&&&&&&3.1.3 miR400 与宿主基因共转录62-64&&&&3.2 拟南芥 miR400 表达模式分析64-66&&&&&&&&3.2.1 启动子活性检测载体构建64&&&&&&&&3.2.2 转基因拟南芥 GUS 染色及活性分析64-66&&&&3.3 拟南芥 miR400 对低温胁迫的响应66-69&&&&&&&&3.3.1 低温胁迫诱导 miR400 及宿主基因表达66-68&&&&&&&&3.3.2 低温胁迫在转录水平上调控 miR400 及宿主基因表达68-69&&&&3.4 拟南芥 miR400 对高温胁迫的响应69-72&&&&&&&&3.4.1 高温胁迫诱导 miR400 原初转录物的表达69-71&&&&&&&&3.4.2 高温胁迫抑制 miR400 成熟体的表达71-72&&&&3.5 高温胁迫诱导 miR400 可变剪切的发生72-75&&&&&&&&3.5.1 高温胁迫诱导 miR400 可变剪切的分析72-73&&&&&&&&3.5.2 可变剪切的发生造成 miR400 前体转录物的积累73-75&&&&3.6 高温胁迫触发的可变剪切影响 miR400 成熟体的表达75-78&&&&&&&&3.6.1 可变剪切载体的构建75-77&&&&&&&&3.6.2 可变剪切对 miR400 成熟体的影响77-78&&&&3.7 剪切信号对 miR400 可变剪切的影响78-81&&&&&&&&3.7.1 高温胁迫下 miR400 剪切信号的变化78-80&&&&&&&&3.7.2 可变剪切信号对 miR400 加工的影响80-81&&&&3.8 可变剪切重要蛋白 SR 对 miR400 加工过程的影响81-83&&&&3.9 拟南芥 miR400 的功能研究83-86&&&&&&&&3.9.1 miR400 超表达载体构建与 miR400 突变体纯合体筛选83-84&&&&&&&&3.9.2 miR400 参与植物抵御高温胁迫的功能分析84-86&&&&3.10 拟南芥 miR400 靶基因的筛选和初步鉴定86-88&&&&&&&&3.10.1 miR400 靶基因筛选86-87&&&&&&&&3.10.2 miR400 靶基因鉴定87-88&&&&3.11 可变剪切调控 miRNA 机制的普遍性88-89&&&&3.12 拟南芥内含子 miRNA 分析89-91&&&&3.13 拟南芥受可变剪切调控 miRNA 筛选91-92&&&&3.14 玉米气生根发育相关 miRNA 的分离与鉴定92-954 讨论95-995 结论99-101参考文献101-110致谢110-111攻读学位期间发表论文情况111
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