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问题已解决悬赏丁当:30
最近做蛋白质相互作用相关的课题，在纯化蛋白后有老师提议使用native page跑一个来证实蛋白复合体，但是自己实验室里没有人做过。对于查到的资料都是转来转去的，很多实际情况并没有说明。我现在的疑问如下:1、bule native page 中说利用的是蛋白的等电点进行分离，蛋白酸碱是要在不同体系里跑的，问题是如果是蛋白复合体，如何判断酸或是碱？不可能在一块胶内不分酸碱也不破坏蛋白结构的将蛋白分离是吗？2、胶的浓度需要选择吗？3、碱性蛋白分离使用的示踪剂是甲基绿，溴酚蓝或者甲基蓝什么的可以代替么？4、如果我要在跑完胶之后继续WB可否，如果可以要注意一些什么？我自己按照碱性胶跑过一次碱性的蛋白，银染是有条带但是跑的非常紧，也按一般变性胶转膜做了WB，目的条带曝光显示挤在起始处，是没有分开的。希望是真正做过的人给些意见，非常感激！！
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醒来继续睡 edited on
醒来继续睡 最近做蛋白质相互作用相关的课题，在纯化蛋白后有老师提议使用native page跑一个来证实蛋白复合体，但是自己实验室里没有人做过。对于查到的资料都是转来转去的，很多实际情况并没有说明。我现在的疑问如下:1、bule native page 中说利用的是蛋白的等电点进行分离，蛋白酸碱是要在不同体系里跑的，问题是如果是蛋白复合体，如何判断酸或是碱？不可能在一块胶内不分酸碱也不破坏蛋白结构的将蛋白分离是吗？2、胶的浓度需要选择吗？3、碱性蛋白分离使用的示踪剂是甲基绿，溴酚蓝或者甲基蓝什么的可以代替么？4、如果我要在跑完胶之后继续WB可否，如果可以要注意一些什么？我自己按照碱性胶跑过一次碱性的蛋白，银染是有条带但是跑的非常紧，也按一般变性胶转膜做了WB，目的条带曝光显示挤在起始处，是没有分开的。希望是真正做过的人给些意见，非常感激！！做纯化蛋白的相互作用标准的方法应该是 gst 或者his 的pull down
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我用的是类似重组蛋白tag标签，但是对于送往质谱的样本仍不确定，是否纯化下来的是需要的而不是其他杂蛋白。所以有建议，用native page，如果在目的条带之外还能鉴定到高分子量的蛋白，则有信有蛋白复合体存在。希望可以获得更多信息，仅有丁当贡献不惜。
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醒来继续睡 我用的是类似重组蛋白tag标签，但是对于送往质谱的样本仍不确定，是否纯化下来的是需要的而不是其他杂蛋白。所以有建议，用native page，如果在目的条带之外还能鉴定到高分子量的蛋白，则有信有蛋白复合体存在。希望可以获得更多信息，仅有丁当贡献不惜。有高分子量的条带如果是自身的聚体呢？所以这个实验本身不能说明有没有相互作用。还要依赖于其他实验。如果你有候选的相互作用蛋白，那就用这个蛋白的抗体去检测pull down实验结合下来的复合物。如果想找一些相互作用蛋白，那就那就用tag挂柱，再用细胞裂解液等待选pool过柱子。挂完柱子以后直接跑sds-page，银染割胶打质谱。
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是的，这个实验只是用来辅助看一下纯化的结果，我之前完成的纯化跟你说的是一致的，本来是想跑完银染割胶质谱，就如我看到的大多数同类研究方法流程一样，但是实验室老师让我再多做一个，所以就变成我现在的问题。那么是做做看？还是说服老师这个其实不必要做？自己私下想试试看多知道一个试验方法，还望指点。
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native page gel没什么好做的，做了也不能说明2个蛋白有相互作用。
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luch75 native page gel没什么好做的，做了也不能说明2个蛋白有相互作用。能具体说一下么，原本只是想用来辅佐证明。但是似乎做的人不多，谢谢！
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能否把你做的native-PAGE的方法告诉我呢，我目前也准备做
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长衣飘飘 能否把你做的native-PAGE的方法告诉我呢，我目前也准备做我也想告诉你，但是没有人回答我啊，我自己摸索做了一次，蛋白跑不下来，没有区分酸碱。配制使用体系去掉SDS等变性剂，APS和TEMED加倍。
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关于丁香园在sds-page中样品为什么要在沸水中煮几分钟
无视即可56295
通过加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也将解离为单亚基.同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）.经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的,分离的状态.
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Native-PAGE 电泳条带都很靠近点样孔，分离效果也不好，有什么方法可以改善？
最近做Native-PAGE电泳，分离胶是17%，浓缩胶5%，用40%的聚丙烯酰胺，电压90,120V.但是蛋白条带都很靠近点样孔，有什么方法可以让条带往下移一些？加大电压可以吗？还是要调整分离胶的浓度？
能告诉我配方吗？
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随时随地聊科研请教：Native-PAGE方法 - 实验交流 - 生物秀
标题: 请教：Native-PAGE方法
摘要: 请教：Native-PAGE方法本人想通过Native-PAGE，然后切目的蛋白带，电洗入透析袋的方法纯化蛋白，我在园内搜索了一下，没有较完整、具体的方法。请高手们赐教，万分感谢！！ 关键词:[目的蛋白 透析 纯化蛋白]……
本人想通过Native-PAGE，然后切目的蛋白带，电洗入透析袋的方法纯化蛋白，我在园内搜索了一下，没有较完整、具体的方法。请高手们赐教，万分感谢！！
1，电泳分离你的样品2，染色，可以选择考染，银染或者活性染色3，用手术刀切下你所要的条带，切成小碎片，尽量小4，将碎片装到透析袋中，扎好，避免气泡5，水平电泳槽，加入与PAGE同样的电极缓冲液，80mA电泳2h，然后反向电泳1min6，取出偷袭袋，在重蒸水或者合适的缓冲液中透析7，透析完毕，冷冻干燥浓缩，或者采用其他方法浓缩8，电泳检查
谢谢spore的答复，请问进行Native-PAGE的时候，除不加SDS外，其它与通常的SDS-PAGE有什么不同，用什么Buffer好？我的目的蛋白pI值为9.1，分子量大概22KD，有没有具体的Native-PAGE方案，谢谢！！
接着楼主的问题，非变性胶的marker也是专用的吧？哪个公司的比较好？
4，将碎片装到透析袋中，扎好，避免气泡5，水平电泳槽，加入与PAGE同样的电极缓冲液，80mA电泳2h，然后反向电泳1min能否详细描述一下，水平怎么电泳呢
spore 这样的蛋白没活性吧？
关于Native-PAGE方法：http://www.bio.mtu.edu/campbell/bl4820/lectures/lec7/482w71.htmNative PAGE 的原理详细介绍http://www.msstate.edu/dept/Biochemistry/faculty/willeford/proteins/nativepage.htmlProtocol http://www.msu.edu/user/delgadoi/112.htmlSDS/Native gradient PAGE 液体配置http://www.serva.de/products/knowledge/041334.shtmlProtein Markers for Native PAGE /aptrix/upp01077.nsf/Content/Products?OpenDocument&parentid=40294&moduleid=40297&zone=ElphoSDS & Native PAGE, IEF Kit （包括具体的解决问题策略）有空了整理一下，应该足够了。
本人想通过Native-PAGE，然后切目的蛋白带，电洗入透析袋的方法纯化蛋白，我在园内搜索了一下，没有较完整、具体的方法。请高手们赐教，万分感谢！！先搜索再提问是正确的方法，不过这位新朋友好像没有很仔细的搜过，或者是没有掌握技巧。下面的贴子应该对你有用：/bbs/thread/962406
谢谢各位朋友的解答！其实，司马不光和spore的解答我在园内通过输入“回收蛋白”早已搜索到，除了司马不光上面贴的外还有好几个链接，我从都到尾每个帖都看了；yxiangmind提供的链接我也在google上通过输入“native-PAGE”已早搜索到，并都已打印下来。但是我的问题还是没有解决，我的目的蛋白pI值为9.1，而一般的PAGE分离胶的最碱的buffer也是pH8.8，在pH8.8时我的目的蛋白应该带正电，但一般电泳是从负极向正极电泳的？请问我的分离胶中buffer及电泳buffer用多大pH，buffer成分用什么？谢谢
我没做过native-PAGE，在这里说两点外行人的看法。1、我觉得buffer要配成PH&9.1并不是什么难事，用Tris-HCl应该就可以。2、为什么不可以就让它从正极往负极走呢？这样应该还可以除去一大堆杂蛋白
呵呵，问题都解决了吧？谢谢楼上的。。
致hywang ：你的蛋白属于碱性蛋白，需要用碱性蛋白的电泳条件来分离，而不是那种最常用的Tris-Gly缓冲系统，那样的话，你的蛋白很可能跑不到分离胶中去！请参考我以前发的帖子来自于蛋白质技术手册)/bbs/thread/1046226Native PAGE 分离碱性蛋白，要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂。 做出来的话，来回个话，让我们知道一下，OK?
spore的方法不错！不过，想纯化或回收你的目的蛋白，既然已知它的等电点和分子量，用凝胶过滤层析和离子交换层析就可以了，为什么要用Native-PAGE，然后切目的蛋白带，电洗入透析袋的方法纯化，挺麻烦的，损失大，对其活性也有影响。
其实PAGE的分辨率比过柱要高得多，如果你有一个杂蛋白和目的蛋白差1~2KDa的话，PAGE分离后电洗脱不失为一种非常好的方法。我认为，做得仔细的话，回收率还是可以的！而且，酶活一般可以保留，除非酶蛋白特别热敏和不稳定。
看了上面各位朋友的讨论，收获不少。不过请问：切下目的蛋白带，切成小碎片，电洗入透析袋时，为什么要80mA电泳2h，我们平时SDS-PAGE电泳半小时就走很远了，为什么要2小时，时间长了不把蛋白转印在透析袋的膜上了？
看了上面各位朋友的讨论，收获不少。不过请问：切下目的蛋白带，切成小碎片，电洗入透析袋时，为什么要80mA电泳2h，我们平时SDS-PAGE电泳半小时就走很远了，为什么要2小时，时间长了不把蛋白转印在透析袋的膜上了？我也不太清楚，你觉得时间太长可以缩短一下。没有一定的指规的！蛋白肯定最后都聚集在透析袋的一侧，所以再反向电泳一会儿，让他们跑下来呀，，，
看了上面各位朋友的讨论，收获不少。不过请问：切下目的蛋白带，切成小碎片，电洗入透析袋时，为什么要80mA电泳2h，我们平时SDS-PAGE电泳半小时就走很远了，为什么要2小时，时间长了不把蛋白转印在透析袋的膜上了？电泳时间主要是根据你的目的蛋白质的性质来决定，因为NATIVE-PAGE和SDS-PAGE是不一样的，NATIVE-PAGE中蛋白质的迁移不仅和目的蛋白质的带电性质有关，同时也和蛋白质的分子形状以及蛋白质的分子量有关，而SDS-PAGE中，蛋白质本身的性质被SDS所屏蔽，蛋白质的迁移只和蛋白质的分子量有关；一般来说NATIVE-PAGE中蛋白质的迁移要慢一些，所以电洗脱的时间要长一些，尤其是你对蛋白质的性质不太了解的。电洗脱的时间长了是不会把蛋白转印在透析袋的膜上的，因为透析袋里面是胶被缓冲液所浸泡。
谢谢！我明白了不少。
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做蛋白质native电泳为何样品聚集在分离胶顶部不往下跑
最近在做native电泳，为何我的样品全都聚集在分离胶顶部，不往下走，而mark跑得还挺好呢。
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您第二点说的缓冲液，是指什么缓冲液呢，上样缓冲液嘛？
电极缓冲液
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