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【求助】关于酿酒酵母的同源交换问题
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这个帖子发布于9年零246天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好!最近在做利用酿酒酵母系统的异源表达。大致过程是要把一个线性化的质粒转化到酿酒酵母，经同源双交换(基因打靶)整合进酵母基因组里表达。查了一些文献，但有一些不确定的地方，在这里提出来请大家指教：1、目的片段两侧的同源交换区一般是30~45bp，这个长度是越长越好呢 还是至少要有30~45 ？有没有最佳的适用范围？2、线性载体在实验方案里是先连接到质粒载体上，再经双酶切后得到的。如此在两侧交换臂的外侧，即5‘交换臂的5‘端和3‘交换臂的3‘端将会有几个游离碱基，他们是酶切位点的残留序列。请问这种游离会不会影响同源交换的过程？（考虑到酵母双交换的几种模型，似乎交换叉形成需要通过同源区的配对来延伸，游离碱基会不会有类似于PCR反应的游离3‘的效应？）3、URA3基因可以用作反式筛选，请问效果如何？在这方面我们的经验比较少，希望得到广大xdjm的帮助，做没做过的都来说说看法，小生在此谢过！
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没有做过这个实验，仅供参考1。个人认为长一些好，链霉菌好像在100bp-1000bp同源交换呢，我做的是酵母表达，都是公司提供的载体，基本上也有上百bp同源区交换，因此应该是至少30-45bp吧2。个人认为影响不大，不过要看多长了。另外如果可以的话可考虑处理一下去掉它放心，具体机制由于不是做这个的没有深入查阅过文献3。URA3基因这个不知道，没有做过另外如果做酵母的异源表达的话，一般现在都在使用通用的方法及载体了，比如毕赤酵母的pPIC系列和pGAP系列等，方法、操作等都是通用的，一方面你可参考一下，另外不知你为什么用这个体系？自己构建？而不用现成的反方法呢？有什么优势吗？
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风之力量 大家好!最近在做利用酿酒酵母系统的异源表达。大致过程是要把一个线性化的质粒转化到酿酒酵母，经同源双交换(基因打靶)整合进酵母基因组里表达。查了一些文献，但有一些不确定的地方，在这里提出来请大家指教：1、目的片段两侧的同源交换区一般是30~45bp，这个长度是越长越好呢 还是至少要有30~45 ？有没有最佳的适用范围？2、线性载体在实验方案里是先连接到质粒载体上，再经双酶切后得到的。如此在两侧交换臂的外侧，即5‘交换臂的5‘端和3‘交换臂的3‘端将会有几个游离碱基，他们是酶切位点的残留序列。请问这种游离会不会影响同源交换的过程？（考虑到酵母双交换的几种模型，似乎交换叉形成需要通过同源区的配对来延伸，游离碱基会不会有类似于PCR反应的游离3‘的效应？）3、URA3基因可以用作反式筛选，请问效果如何？在这方面我们的经验比较少，希望得到广大xdjm的帮助，做没做过的都来说说看法，小生在此谢过！呵呵，同行。1、目的片段两侧的同源交换区一般是30~45bp（这里强调一下，利用的方法是PCR介导的一步基因置换法，而非传统的载体介导的基因置换），对于酿酒酵母来说，最佳的适用范围就是30~45bp，其它物种则是话外。2、线性载体在实验方案里是先连接到质粒载体上，再经双酶切后得到的。如此在两侧交换臂的外侧，即5‘交换臂的5‘端和3‘交换臂的3‘端将会有几个游离碱基，他们是酶切位点的残留序列。这种游离不会影响同源交换的过程。传统的基因置换法是利用线性化载体（携带同源重组臂）进行转化，呵呵，“游离”得更多吧。3、URA3基因可以用作反式筛选，效果还好。不仅是酿酒酵母，其它新建的非常规酵母研究系统，大多是利用URA3基因可以用作双向选择标记。就是5-FOA贵了点，我这里联系到一个药厂可以合成5’-FOA，纯度稍低，但比起国外的价格可是便宜多了。如果需要，可以发给你联系方式。效果还不错的说。以后有什么问题可以讨论，同行，嘿嘿。
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raimi edited on
没有做过这个实验，仅供参考1。个人认为长一些好，链霉菌好像在100bp-1000bp同源交换呢，我做的是酵母表达，都是公司提供的载体，基本上也有上百bp同源区交换，因此应该是至少30-45bp吧2。个人认为影响不大，不过要看多长了。另外如果可以的话可考虑处理一下去掉它放心，具体机制由于不是做这个的没有深入查阅过文献3。URA3基因这个不知道，没有做过另外如果做酵母的异源表达的话，一般现在都在使用通用的方法及载体了，比如毕赤酵母的pPIC系列和pGAP系列等，方法、操作等都是通用的，一方面你可参考一下，另外不知你为什么用这个体系？自己构建？而不用现成的反方法呢？有什么优势吗？
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多谢SmallDonkey的回答！之所以要自己构建载体，是因为目的菌株中的一个基因是我们不想要的，基因打靶的目的一方面在于转进我们自己这个基因，另一方面是敲除菌株里现有的基因。
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为了避免走弯路，还是决定用酶切的方法得到一个两端不游离的同源臂。可是测序结果昨天回来了，一直到302个碱基时才能找到酶切位点，比起30~45来说有些过长了。这么长的同源区可以用吗？会有哪些影响？谢谢~
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风之力量 大家好!最近在做利用酿酒酵母系统的异源表达。大致过程是要把一个线性化的质粒转化到酿酒酵母，经同源双交换(基因打靶)整合进酵母基因组里表达。查了一些文献，但有一些不确定的地方，在这里提出来请大家指教：1、目的片段两侧的同源交换区一般是30~45bp，这个长度是越长越好呢 还是至少要有30~45 ？有没有最佳的适用范围？2、线性载体在实验方案里是先连接到质粒载体上，再经双酶切后得到的。如此在两侧交换臂的外侧，即5‘交换臂的5‘端和3‘交换臂的3‘端将会有几个游离碱基，他们是酶切位点的残留序列。请问这种游离会不会影响同源交换的过程？（考虑到酵母双交换的几种模型，似乎交换叉形成需要通过同源区的配对来延伸，游离碱基会不会有类似于PCR反应的游离3‘的效应？）3、URA3基因可以用作反式筛选，请问效果如何？在这方面我们的经验比较少，希望得到广大xdjm的帮助，做没做过的都来说说看法，小生在此谢过！呵呵，同行。1、目的片段两侧的同源交换区一般是30~45bp（这里强调一下，利用的方法是PCR介导的一步基因置换法，而非传统的载体介导的基因置换），对于酿酒酵母来说，最佳的适用范围就是30~45bp，其它物种则是话外。2、线性载体在实验方案里是先连接到质粒载体上，再经双酶切后得到的。如此在两侧交换臂的外侧，即5‘交换臂的5‘端和3‘交换臂的3‘端将会有几个游离碱基，他们是酶切位点的残留序列。这种游离不会影响同源交换的过程。传统的基因置换法是利用线性化载体（携带同源重组臂）进行转化，呵呵，“游离”得更多吧。3、URA3基因可以用作反式筛选，效果还好。不仅是酿酒酵母，其它新建的非常规酵母研究系统，大多是利用URA3基因可以用作双向选择标记。就是5-FOA贵了点，我这里联系到一个药厂可以合成5’-FOA，纯度稍低，但比起国外的价格可是便宜多了。如果需要，可以发给你联系方式。效果还不错的说。以后有什么问题可以讨论，同行，嘿嘿。
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raimi edited on
1、目的片段两侧的同源交换区一般是30~45bp，对于酿酒酵母来说，最佳的适用范围就是30~45bp，其它物种则是话外。原来才这么短(?)那为什么毕赤酵母的表达载体同源交换的部分有几百到几kb这么大？酿酒酵母与毕赤酵母差别就好大了。。。。
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SmallDonkey 原来才这么短(?)那为什么毕赤酵母的表达载体同源交换的部分有几百到几kb这么大？酿酒酵母与毕赤酵母差别就好大了。。。。呵呵，这里强调一下，利用的方法是PCR介导的一步基因置换法，而非传统的载体介导的基因置换。SmallDonkey战友说的是传统方法。莫混淆:)传一篇文章大家一块学习下下。8D:P
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感谢！学习中。。。
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谢谢raimi斑竹！连5‘-FOA都帮我想到了，真是太体贴了:) 建议你自己给自己加分~呵呵文章看过了，老外的东西就是干脆利索，才1.5页。最后还有个小问题：我还是搞不清楚传统的利用载体的交换和PCR一步基因置换法在原理上有什么区别？为什么对同源区长度的需求会有差别？
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想请问下：5-FOA缺陷型菌株你们是自己筛选的吗？还是公司买的菌种我也在准备开始类似的工作，刚进实验室，好多都不懂URA的选择标记都不太理解，请指点下，谢谢！
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照着这种方法做，结果敲除ura3后，sd、sd+ura都不能生长是什么原因
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关于丁香园GAL3敲除对酿酒酵母生理及乙醇发酵性能的影响--《广西大学》2015年硕士论文
GAL3敲除对酿酒酵母生理及乙醇发酵性能的影响
【摘要】：GAL3基因在真核生物中广泛存在。酵母同样为真核生物,与人类的基因具有相关性,可以作为人类基因功能研究的参考,而且是单细胞,具有生活史短,容易培养等优点。人类的历史同样是一部酿酒酿造史。如今的社会早已与乙醇无法割舍。乙醇除了用于人们的日常饮食外,同时还用于医药、化工、食品等行业。酿酒酵母的基因功能以及发酵性能一直是研究的重点与热点。酿酒酵母GAL3基因(ORF编号为GAL3)编码表达GAL3p,是酿酒酵母半乳糖代谢中一个感应和信号传导的基因。在以半乳糖为唯一碳源的培养基中,在ATP的协助下,GAL3蛋白能与酵母半乳糖代谢中的抑制因子GAL80结合,从而使转录激活因子GAIA能够转录使酵母半乳糖代谢能够顺利进行。本文以MF1015为出发菌株,构建两种单倍体菌株并通过同源重组敲除两种单倍体的GAL3基因,再将敲除的单倍体菌株进行复倍,得到一株GAL3突变体菌株,研究其生理特征以及乙醇发酵特性。本实验构建了MF1015菌株的a型和α型单倍体,并合成GAL3基因敲除组件,成功将GAL3基因敲除组件转入两种单倍体中。利用敲除组件中的G418抗性进行筛选,得到敲除GAL3基因后的单倍体突变菌株,然后转入pSH65表达质粒,利用半乳糖诱导消除G418抗性基因,再传代遗失得到丢失pSH65质粒的突变菌株。将两种单倍体突变体菌株接入到YPD培养基让其自然交配并复倍,从而得到突变体MF1015-ΔGAL3。测定野生型菌株和突变体菌株的基本生理状态及乙醇发酵性能,与野生型菌株相比,突变体菌株生长速率变慢,细胞形态由近似圆形变成椭圆形,呼吸作用降低,耐乙酸能力有明显升高,耐乙醇能力略有降低；同时,对葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、乳糖、半乳糖等糖的利用能力也略有降低。在环境中同时存在葡萄糖和半乳糖时,野生型菌株优先利用葡萄糖,葡萄糖耗尽后,野生型菌株对半乳糖利用会延迟6小时左右,这种现象称为葡萄糖阻遏。而敲除GAL3基因的突变体菌株这种延迟达2-5天,并且其耐半乳糖的耐受性也降低。在糖蜜补料发酵实验中,野生型和突变体发酵产生的乙醇最大浓度分别为(13.13±0.18)%和(12.7±0.17)%,其中对糖的利用率野生型高1.6%。在蔗糖发酵实验中,野生型产生乙醇浓度为(14.05±0.28)%,突变型为(13.0±0.58)%。结果说明GAL3突变对于酿酒酵母的生理特征以及乙醇发酵均有影响。
【关键词】：
【学位授予单位】：广西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：Q93;TQ920.1;TQ223.122【目录】：
摘要4-6ABSTRACT6-12第一章 前言12-20 1.1 酿酒酵母Leioir途径中的酶13
1.1.1 半乳糖激酶(GAL1)13
1.1.2 1-磷酸半乳糖尿苷转移酶(GAL7)13
1.1.3 变旋酶,差向异构酶(GAL10)13 1.2 半乳糖代谢基因表达的调控13-17
1.2.1 GAL4——转录激活因子13-14
1.2.2 GAL80录抑制因子14
1.2.3 GAL3——信号感应与传导蛋白14
1.2.4 各个调控蛋白之间的关系14-15
1.2.5 两种GAL基因表达调控模型15-16
1.2.6 GAL3信号感应与传导蛋白研究进展16-17 1.3 课题介绍与研究17-20
1.3.1 课题研究的目的与意义17-19
1.3.2 实验技术路线19-20第二章 材料与方法20-36 2.1 实验材料20-23
2.1.1 培养基20-21
2.1.2 菌株与质粒21
2.1.3 酶和主要试剂21
2.1.4 其他试剂21-22
2.1.5 仪器设备22-23 2.2 实验方法23-36
2.2.1 菌株的活化和培养23
2.2.2 菌株保藏23
2.2.3 酿酒酵母单倍体制备23-27
2.2.3.1 子囊孢子制备的方法23
2.2.3.2 制备酿酒酵母单倍体菌株23
2.2.3.3 单倍体的鉴定23-24
2.2.3.4 酿酒酵母总DNA的提取24-25
2.2.3.5 酿酒酵母感受态的制备25
2.2.3.6 大肠杆菌感受态制备25-26
2.2.3.7 大肠杆菌的转化26
2.2.3.8 GAL3基因完整性的验证26-27
2.2.4 敲除组件的构建27-32
2.2.4.1 敲除组件引物设计27-28
2.2.4.2 酿酒酵母转化28-29
2.2.4.3 筛选转化子29-30
2.2.4.4 去除KanMX抗性标记30
2.2.4.5 单倍体复倍30-31
2.2.4.6 生长曲线的测定31
2.2.4.7 葡萄糖阻遏作用的研究31
2.2.4.8 蔗糖发酵实验31
2.2.4.9 糖蜜发酵实验31-32
2.2.5 酒精度的测定32-33
2.2.5.1 取样32
2.2.5.2 气相色谱测乙醇含量32
2.2.5.3 含糖量的测定32-33
2.2.6 氧含量对乙醇发酵的影响33
2.2.7 酿酒酵母细胞形态观察33
2.2.8 出芽率的检测33
2.2.9 产孢率的检测33
2.2.10 酵母的假菌丝33-34
2.2.11 细胞壁生理检测34
2.2.12 乙酸耐受性测试34
2.2.13 乙醇耐受性测试34
2.2.14 碳源同化研究34
2.2.15 相对呼吸强度的测定34-35
2.2.16 高温耐受性实验35-36第三章 结果与分析36-65 3.1 GAL3基因的敲除36-43
3.1.1 MF1015单倍体制备36-37
3.1.2 GAL3基因完整性验证37-38
3.1.3 敲除组件的构建38-39
3.1.4 转化子验证39-40
3.1.5 单倍体复倍40-42
3.1.6 抗性标记的去除42-43 3.2 菌株生理特性和发酵性能的研究43-65
3.2.1 生长曲线43-46
3.2.2 蔗糖和糖蜜发酵的结果46-47
3.2.3 糖蜜和蔗糖发酵性总糖的检测结果47-48
3.2.4 半乳糖发酵48-49
3.2.5 氧含量对乙醇发酵的影响49-51
3.2.6 葡萄糖对半乳糖利用抑制作用的研究51-55
3.2.7 乙酸耐受性结果55
3.2.8 乙醇耐受性结果55-56
3.2.9 酿酒酵母高温耐受性检测56-57
3.3.10 相对呼吸强度的测定57-58
3.3.11 酿酒酵母单菌落及细胞的形态特征58-59
3.3.12 出芽率的检测59-61
3.3.13 产孢率的检测61
3.3.14 酵母假菌丝形成61-63
3.3.15 细胞壁生理检测63
3.3.16 碳源同化实验63-65第四章 讨论65-67 4.1 酿酒酵母单倍体的筛选65 4.2 GAL3基因的敲除及突变菌株生理分析65-67第五章 结论与展望67-69 5.1 结论67-68 5.2 展望68-69参考文献69-77附录177-79致谢79-80攻读学位期间发表的学术论文80
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练梅华;[D];广西大学;2015年
王汝瑱;[D];西北农林科技大学;2011年
王影;[D];吉林大学;2012年
薛军侠;[D];西北农林科技大学;2007年
罗沙;[D];北京化工大学;2012年
全艳彩;[D];暨南大学;2010年
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酿酒酵母转化问题
如题，做了2个月的酿酒酵母化转，效率极其低啊，用的URA缺陷型培养基筛选，找到不原因啊
想问下&&您做过醋酸锂转化吗？&&我看了下转化体系 是按照文献上来的啊 。。也是按着步骤来的。。。。完全不知道为什么啊&&。。。有木有什么微生物扣扣群啊 ？ :tuzi3
请问，您做过这方面的实验吗？
国产文献貌似不怎么可靠，找一下外文文献吧......
我现在觉得 会不会是ssDNA的问题&&，想问下 鲱鱼精DNA （D3159，sigma)&&与 鲑鱼精DNA （D1626,sigma) 有什么区别？ 实验室买的是鲱鱼精的，这个会不会对转化有影响呢？ 谢谢
哎。。。想下的文献 下不了，比如这篇 High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method。。。。
这个貌似是自然杂志上的文章哦......要收费的，我这的服务器没有购买这个数据库，帮不了你....
没事，还是很谢谢你。:)
我想问问，醋酸锂转化，要多少质粒，我用10微升都出不来，不知道是哪里的问题，希望可以指点一下，谢谢
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【求助】一个酵母表达蛋白的问题
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【求助】一个酵母表达蛋白的问题
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痛苦了很长时间了。
我用酵母菌表达一种蛋白，完了拿培养液上清液进行SDS-PAGE电泳检测
结果除了MARK外，没有其他任何条带，连杂蛋白都没有，有时甚至连MARK
带都看不到为此，极度郁闷，日日思虑到黄昏，夜夜失眠到天明。
各位大哥知道是什么原因吗？谢谢！
我PAGE用的是12%的分离胶和5%的浓缩胶，总分子量约为15KD左右。
我试了用丙酮沉淀浓缩蛋白，但是结果........郁闷啊。。丙酮沉淀我的酵母培养（离心）上清液后，发现管底有一层比较粘稠又油的东西，白色的蛋白浮在这层上面。不知道是什么东西，蛋白提取就很麻烦，电泳结果也没有条带
从头到尾，我一直用的YPDS培养液，我的蛋白是分泌型的，不知道这个有没有问题
郁闷得快哭了
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酵母表达量不高的时候，跑胶是看不到带的，做个western或者银染看看
不过mark也看不到，那就是跑胶出了问题
你做的时候，最好要同时跑个阳性（确认表达）和阴性（为转化的空菌或者诱导前的样品）对照
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酵母表达量一般不高,大部分都是分泌到培养基表达的。表达的时间段也很长,有的甚至要4天才表达。跑电泳时要浓缩的,要不肯定很能看到有蛋白了,我们实验室一般都是取1ml 的酵母上清表达液加上100微升的丙酮或三氯醋酸,蛋白变性2h或过夜后高速离心,沉淀溶于20-40微升的尿素中去跑SDS-PAGE电泳。不过表达量太低是要做Western或银染去验证的,验证有表达再去优化表达条件呐。
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白变性2h或过夜后高速离心一般多少速度？
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我跑胶都是按步骤来的，为什么mark跑出来的时候，其他孔连杂蛋白都跑不出来呢？
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酵母表达一般分泌出来的蛋白是不多的，杂蛋白就更少了，跑不出来是很正常的。
建议你做个western，才能确定究竟有没有表达
采用有机溶剂沉淀蛋白质，温度和沉淀时间很重要。但不排除沉淀后得到很多杂质的可能，所以要严格控制低温和比例，常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。
沉淀后离心速度一般在1g，然后复溶，再做SDS-PAGE
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我觉得问题可能不一定出在表达上面，可能做胶的步骤或者试剂也有出问题的可能性。再在其他方面找找问题看看。毕竟marker也有时候跑出来。
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恩。非常感谢！
正在培养，打算按照大哥们的方法做做看。
是蛋白溶液是丙酮的10倍吧？
前面两为大哥的说法不一致....
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实验还是很失败，大哥大姐们还有有什么建议吗？
谢谢了！！